Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción diferencial de metabolitos especializados

Uno de los desafíos actuales en el estudio de productos naturales de microorganismos es el re-aislamiento frecuente de compuestos conocidos. De otro lado, es conocido que múltiples clústers de genes que pueden codificar para metabolitos permanecen silenciados en condiciones estándares de laboratorio...

Full description

Autores:: Martínez Buitrago, Paola Andrea

Tipo de recurso:

Fecha de publicación:: 2019

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

Description
Summary:	Uno de los desafíos actuales en el estudio de productos naturales de microorganismos es el re-aislamiento frecuente de compuestos conocidos. De otro lado, es conocido que múltiples clústers de genes que pueden codificar para metabolitos permanecen silenciados en condiciones estándares de laboratorio. Con el fin inducir la expresión de estos genes, se han desarrollado varios métodos que incluyen el co-cultivo de microorganismos, cuyo uso se ha incrementado en los últimos años. En este contexto, esta tesis de maestría se propuso implementar metodologías de selección y estudio co-cultivos de microorganismos que condujeran a la identificación de compuestos inducidos por la interacción de los microorganismos seleccionados. Como primer paso se revisaron 100 artículos de co-cultivos, buscando identificar los criterios más usados para la selección de microorganismos. Se encontró que, en la mayoría de los reportes, los co-cultivos seleccionados provienen de un screening de múltiples parejas de un cepario o que los autores no reportan cómo se llevó a cabo el proceso de selección. En los demás reportes se pudieron identificar los siguientes seis criterios: conocimiento previo de los microorganismos, criterio ecológico o parejas formadas por microorganismos recuperados de la misma muestra biológica, Actinobacteria vs. bacteria con ácido micólico en su pared celular, bacteria del género Streptomyces sp. vs. bacteria del género Streptomyces sp., bacteria del género Streptomyces sp. vs. Proteobacteria, y enfrentamiento con patógenos. Algunos de estos criterios se emplearon para seleccionar 15 microorganismos a partir del cepario del grupo de investigación, que contiene más de 200 microorganismos. Este set de microorganismos estaba conformado por 14 bacterias y un hongo, para su inclusión se emplearon como criterios de selección al menos uno de los que se mencionan a continuación: conocimiento previo de su producción química y/o actividad biológica, bacteria con ácido micólico en su pared celular, microorganismos recuperados de la misma muestra, y bacteria perteneciente al género Streptomyces. Posteriormente, se evaluaron todas los posibles co-cultivos binarios (105) en medio líquido a una escala de 15mL. Los extractos orgánicos de estos cultivos fueron analizados por UHPLC-DAD-ELSD, y se seleccionaron 5 parejas que mostraban cambios inducidos por la interacción. Estas 5 parejas fueron cultivadas en una escala de 100mL, donde se encontró que en ninguna de las parejas se observaban los cambios detectados a una escala de 15mL. Sumado a esto, en ninguno de los 5 co-cultivos se garantizó la coexistencia de ambos microorganismos. Teniendo en cuenta estos resultados, se decidió realizar un screening de interacciones en medio sólido, empleando 4 medios de cultivo (PDA, ISP2, ISP3, LB), y evaluando interacciones a distancia e interacciones por contacto. Las primeras permitían evaluar las interacciones debidas a compuestos difusibles; las segundas permitían evaluar interacciones debidas a contacto célula-célula. Se evaluaron cambios fenotípicos inducidos por el co-cultivo y se evaluaron los extractos orgánicos por HPLC-DAD. Las interacciones promisorias fueron analizadas por RMN (experimentos RMN 1H y COSY). A partir de estos resultados se identificaron 7 co-cultivos cuya expresión metabólica era diferente respecto a los monocultivos respectivos, es decir parejas promisorias para el estudio de su producción metabólica. Estas parejas corresponden a: Streptomyces sp. PNM-161a y Rhodococcus sp. RKHC-26 (contacto, LB): Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-123 (distancia, PDA); Purpureocillium sp. PNM-67 y Rhodococcus sp. RKHC-26 (contacto, PDA); Purpureocillium sp. PNM-67 y Streptomyces sp. IBUN-5.1 (distancia, ISP3); Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-115 (distancia, ISP3); Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-123 (distancia, ISP3); y Purpureocillium sp. PNM-67 y Paenibacillus sp. PNM-210 (distancia, ISP3). Los espectros de RMN y los cromatogramas sugieren que en los 4 co-cultivos en medio ISP3, se induce la producción de compuestos iguales o similares pero en concentraciones diferentes. El co-cultivo entre la bacteria Streptomyces sp. PNM-161a y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 por contacto, y en medio LB, se analizó empleando LC-MS/MS y se construyeron redes moleculares que permitieron observar que el co-cultivo induce la producción de una familia molecular. La derreplicación de esta red sugiere la producción de compuestos tipo macrólido y péptido con actividad antibiótica. El estudio del cultivo en mayor volumen (380 cajas) fue seguido por RMN, y permitió evidenciar algunos cambios menores, pero no permitió el aislamiento de compuestos inducidos por el co-cultivo. A partir del extracto orgánico del co-cultivo se aislaron el ácido 5-(2-amino-3-hidroxi-1-(1H-indol-3-il)propil)-2-hidroxibenzoico (4.1) y el ácido antranílico (4.2.). Estos compuestos son producidos por Streptomyces sp. PNM-161a en monocultivo por lo que su producción no es exclusiva al co-cultivo. El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67, y la bacteria con ácido micólico Rhodococcus sp. RKHC-26 por contacto y en PDA, fue analizado por LC-MS/MS. El uso de análisis multivariado, y la construcción de redes moleculares integrado con derreplicación (a partir del GNPS y el Dictionary of Natural Products), permitieron observar que el co-cultivo incrementa la concentración de la leucinostatina A y leucinostatina B, e induce la producción de 4 leucinostatinas ya reportadas. Este co-cultivo constituye el primer reporte de un co-cultivo exitoso entre un hongo y una bacteria con ácido micólico. Los dos co-cultivos por contacto que fueron estudiados demostraron ser poco reproducibles. Es necesario el mejoramiento de las condiciones experimentales con el fin de mejorar la reproducibilidad de estos experimentos. El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Paenibacillus sp. PNM-123 a distancia, y en PDA, fue realizado en mayor volumen (450 cajas de Petri). A partir de su extracto orgánico se aislaron los alcaloides tipo withasomnina de nombres 5,6-dihidro-2-(sec-butil)-4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.1) y 5,6-dihidro-2-isopropil-4H-pirrolo[1,2b]pirazol (5.2), siendo el primero por primera vez reportado en esta tesis. Estos compuestos son inducidos por el co-cultivo, y probablemente producidos por la bacteria Paenibacillus sp. PNM-123 teniendo en cuenta el gradiente de difusión de los mismos. Este tipo de compuestos son poco comunes en la literatura científica de productos naturales obtenidos de microorganismos. El co-cultivo entre el hongo Purpureocillium sp. PNM-67 y la bacteria Streptomyces sp. IBUN-5.1. a distancia, y en medio ISP3, fue realizado en mayor volumen (450 cajas de Petri) teniendo en cuenta que de las 4 interacciones promisorias observadas en medio ISP3, ésta era la que a juzgar por RMN producía mayor cantidad de el(los) compuestos inducidos por el co-cultivo. A partir del extracto orgánico del co-cultivo se aisló el compuesto alternariol (5.3), una micotoxina ampliamente estudiada por estar presente en cultivos de alimentos. Este compuesto es producido por el hongo tanto en esta interacción, como en sus interacciones con las bacterias Paenibacillus sp. PNM-115, Paenibacillus sp. PNM-123 y Paenibacillus sp. PNM-210. Los extractos orgánicos de la zona de la interacción para estos 4 co-cultivos fueron analizados por LC/MS-MS, y se construyeron redes moleculares. Según estos análisis el co-cultivo del hongo con la bacteria Paenibacillus sp. PNM-115 es el más prometedor para su posterior evaluación en mayor volumen pues es el que genera una mayor cantidad de features asociadas exclusivamente a él. Esta tesis es el primer reporte, hasta donde llega nuestro conocimiento, de un estudio químico de co-cultivo de microorganismos como estrategia de inducción de productos naturales en Colombia.

Co-cultivo de microorganismos de origen marino como estrategia para la producción diferencial de metabolitos especializados

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