Mejoramiento del medio de cultivo para producción de la lacasa recombinante POXA 1B de Pleurotus ostreatus en Pichia pastoris

Las lacasas son un tipo de enzimas responsables de procesos de óxido-reducción sobre sustratos de naturaleza aromática. La obtención de estas enzimas a gran escala generalmente no es adecuada cuando se piensa en la secreción por fuentes nativas, por lo tanto, una alternativa es la expresión heterólo...

Full description

Autores:
Tipo de recurso:
masterThesis
Fecha de publicación:
2016
Institución:
Pontificia Universidad Javeriana
Repositorio:
Repositorio Universidad Javeriana
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repository.javeriana.edu.co:10554/20621
Acceso en línea:
http://hdl.handle.net/10554/20621
https://doi.org/10.11144/Javeriana.10554.20621
Palabra clave:
Diseño experimental Plackett-Burman
Diseño one factor
Pichia pastoris
Lacasa recombinante
Estabilidad enzimática mejoramiento
Plackett-Burman design
One factor design
Pichia pastoris
Recombinant laccase
Enzyme stability improvement
Maestría en ciencias biológicas - Tesis y disertaciones académicas
Enzimas
Diseño experimental
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description Las lacasas son un tipo de enzimas responsables de procesos de óxido-reducción sobre sustratos de naturaleza aromática. La obtención de estas enzimas a gran escala generalmente no es adecuada cuando se piensa en la secreción por fuentes nativas, por lo tanto, una alternativa es la expresión heteróloga para obtener rendimientos altos y producción de enzimas en mayor concentración. En un proyecto anterior, el grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI), logró la expresión de la lacasa recombinante POXA IB de Pleurotos ostreatos en Ptchia pastoris bajo el control del promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (pGAP). Con el propósito de aumentar la actividad y la producción de esta enzima, en este trabajo se emprendió el mejoramiento de las condiciones del medio de cultivo mediante diseños estadísticos secuenciales, utilizando un diseño factorial de tipo Plackett-Bur/nan (DEPB) seguido de un diseño experimental One Factor (DEOF) con la consecuente comprobación del resultado final. Se estudió la estabilidad de la enzima a diferentes pHs y temperaturas y como variable respuesta o independiente se seleccionó la actividad enzimática (UL;1). Después del DEOF que permitió mejorar la concentración de extracto de levadura, se logró aumentar la actividad enzimática de 451 ± 6.46 UL;1 obtenida en el trabajo previo a 1343.52 ± 40.3 UL;1, lo que significó un incremento de aproximadamente 2.98 veces la actividad enzimática. Al determinar la estabilidad del sobrenadante concentrado se encontró que se retiene más del 90% de la actividad residual a 50°C y ~50% de la actividad residual a 70°C y que se retuvo el 60% de la actividad residual a pH 10 y el pH óptimo fue de 4, reteniendo más del 90% de la actividad enzimática residual.
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En un proyecto anterior, el grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI), logró la expresión de la lacasa recombinante POXA IB de Pleurotos ostreatos en Ptchia pastoris bajo el control del promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (pGAP). Con el propósito de aumentar la actividad y la producción de esta enzima, en este trabajo se emprendió el mejoramiento de las condiciones del medio de cultivo mediante diseños estadísticos secuenciales, utilizando un diseño factorial de tipo Plackett-Bur/nan (DEPB) seguido de un diseño experimental One Factor (DEOF) con la consecuente comprobación del resultado final. Se estudió la estabilidad de la enzima a diferentes pHs y temperaturas y como variable respuesta o independiente se seleccionó la actividad enzimática (UL;1). Después del DEOF que permitió mejorar la concentración de extracto de levadura, se logró aumentar la actividad enzimática de 451 ± 6.46 UL;1 obtenida en el trabajo previo a 1343.52 ± 40.3 UL;1, lo que significó un incremento de aproximadamente 2.98 veces la actividad enzimática. Al determinar la estabilidad del sobrenadante concentrado se encontró que se retiene más del 90% de la actividad residual a 50°C y ~50% de la actividad residual a 70°C y que se retuvo el 60% de la actividad residual a pH 10 y el pH óptimo fue de 4, reteniendo más del 90% de la actividad enzimática residual.The laccases are a type of enzyme responsible for die oxide reduction process on substrates of aromatic nature. The obtention of dns enzymes in a large scale it is not generally adequate when is through secretion in native sources, dierefore an alternative is die heterologous expression, this allows a greater level of production of die enzymes in higher concentration. In a previous project, die Biotechnological Environmental and Industrial Group (GBAI in Spanish) achieved the production of die recombinant Laccase POXA1B from Pleurotus ostreatus in Ptchia pastoris under control from die promoter of die Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (pGAP). With die purpose to mcrease activity and higher production of dns enzyme, this work was undertaken die improvement of die conditions of the cultivation media by sequential statistical designs, using a factorial design type Plackett Burman (PBED) followed by an One Factor Experimental Design (OFED) with die subsequent proof process of die final result. It was studied enzyme stability at a diferents pHs and temperatures using as a variable independent answer die enzymatic activity (UL;1). After the OFED, winch unproved die concentration of yeast extract, we were able to increase die enzymatic activity from 451 ± 6.46 UL'1 previously obtamed at 1343.52 ± 40.3 UL'1, which meant an increase of approxunately 2.98 times die enzymatic activity. Li determining stability of concentrated supernatant under die different conditions assayed, it was found to be retained more than 90% of the residual activity at 50°C and ~50% of the residual activity at 70°C. At pH 10, die concentrated supernatant retained 60% of die residual activity and die optimal pH was 4, retaining more than 90% of the residual enzymatic activity.Magíster en Ciencias BiológicasMaestríaPontificia Universidad JaverianaMaestría en Ciencias BiológicasFacultad de CienciasPoutou Piñales, Raúl Alberto2017-05-24T20:28:07Z2020-04-16T19:40:12Z2017-05-24T20:28:07Z2020-04-16T19:40:12Z2016http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aaTesis/Trabajo de grado - Monografía - Maestríahttp://purl.org/coar/resource_type/c_bdccinfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionPDFapplication/pdfapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10554/20621https://doi.org/10.11144/Javeriana.10554.20621instname:Pontificia Universidad Javerianareponame:Repositorio Institucional - Pontificia Universidad Javerianarepourl:https://repository.javeriana.edu.cospaAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessDe acuerdo con la naturaleza del uso concedido, la presente licencia parcial se otorga a título gratuito por el máximo tiempo legal colombiano, con el propósito de que en dicho lapso mi (nuestra) obra sea explotada en las condiciones aquí estipuladas y para los fines indicados, respetando siempre la titularidad de los derechos patrimoniales y morales correspondientes, de acuerdo con los usos honrados, de manera proporcional y justificada a la finalidad perseguida, sin ánimo de lucro ni de comercialización. De manera complementaria, garantizo (garantizamos) en mi (nuestra) calidad de estudiante (s) y por ende autor (es) exclusivo (s), que la Tesis o Trabajo de Grado en cuestión, es producto de mi (nuestra) plena autoría, de mi (nuestro) esfuerzo personal intelectual, como consecuencia de mi (nuestra) creación original particular y, por tanto, soy (somos) el (los) único (s) titular (es) de la misma. Además, aseguro (aseguramos) que no contiene citas, ni transcripciones de otras obras protegidas, por fuera de los límites autorizados por la ley, según los usos honrados, y en proporción a los fines previstos; ni tampoco contempla declaraciones difamatorias contra terceros; respetando el derecho a la imagen, intimidad, buen nombre y demás derechos constitucionales. Adicionalmente, manifiesto (manifestamos) que no se incluyeron expresiones contrarias al orden público ni a las buenas costumbres. En consecuencia, la responsabilidad directa en la elaboración, presentación, investigación y, en general, contenidos de la Tesis o Trabajo de Grado es de mí (nuestro) competencia exclusiva, eximiendo de toda responsabilidad a la Pontifica Universidad Javeriana por tales aspectos. Sin perjuicio de los usos y atribuciones otorgadas en virtud de este documento, continuaré (continuaremos) conservando los correspondientes derechos patrimoniales sin modificación o restricción alguna, puesto que, de acuerdo con la legislación colombiana aplicable, el presente es un acuerdo jurídico que en ningún caso conlleva la enajenación de los derechos patrimoniales derivados del régimen del Derecho de Autor. De conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, “Los derechos morales sobre el trabajo son propiedad de los autores”, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. En consecuencia, la Pontificia Universidad Javeriana está en la obligación de RESPETARLOS Y HACERLOS RESPETAR, para lo cual tomará las medidas correspondientes para garantizar su observancia.http://purl.org/coar/access_right/c_abf2reponame:Repositorio Universidad Javerianainstname:Pontificia Universidad Javerianainstacron:Pontificia Universidad Javeriana2022-04-29T19:12:00Z

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