Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex
87 Páginas. Recurso Electrónico
- Autores:
-
Speck Hernández, Cesar Augusto
- Tipo de recurso:
- Fecha de publicación:
- 2013
- Institución:
- Universidad del Tolima
- Repositorio:
- RIUT: Repositorio U. Tolima
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METODOLOGÍA 37 3.1 LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN DONDE SE REALIZO EL ESTUDIO 37 3.2 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN 37 3.3 POBLACIÓN DE ESTUDIO 37 3.4 EXTRACCIÓN DE ADN 38 3.5 CUANTIFICACIÓN DE ADN 38 3.6 NORMALIZACIÓN DE LAS MUESTRAS 38 3.7 OPTIMIZACIÓN DE LA PRUEBA 38 3.7.1 Ensayo 1 38 3.7.2 Ensayo 2 39 3.7.3 Ensayo 3 39 3.7.4 Ensayo 4 39 3.7.5 Ensayo 5 39 3.7.6 Ensayo 6 39 3.7.7 Ensayo 7 39 3.7.8 Ensayo 8 39 3.7.9 Muestras 39 3.7.10 Programa de amplificación 39 3.7.11 Verificación de productos de amplificación 39 3.8 CUANTIFICACIÓN DE LA LONGITUD TELOMÉRICA RELATIVA 40 3.8.1 Reactivos 40 3.8.1.1 Master Mix 40 3.8.1.2 Sonda Fluorescente 40 3.8.1.3 Primers 40 3.8.2 Programa de amplificación 40 3.8.3 Preparación de la prueba 41 3.8.4 Equipo 42 3.8.5 Análisis de resultados 42 3.8.5.1 Curva de Melting 42 3.8.5.2 Eficiencia de la PCR 42 3.8.5.3. Curva de calibración 42 3.8.5.4. Calculo de la proporción T/S 42 3.8.6 Análisis estadísticos 43 4. RESULTADOS 44 4 .1 OPTIMIZACIÓN DE LA PRUEBA 44 4.2 CUANTIFICACIÓN DE LA LONGITUD TELOMÉRICA 52 4.2.1 Descripción de la población 52 4.2.2 Longitud Telomérica 52 4.2.3 Longitud telomérica y edad 53 5. DISCUSIÓN 54 6. CONCLUSIONES 65 7. RECOMENDACIONES 67 REFERENCIAS 68 ANEXOS 83 RESUMEN. Los telómeros son estructuras de DNA que protegen el final de los cromosomas de su degradación y fusión. Son así mismo esenciales para el mantenimiento de la integridad genómica. Los estudios demuestran el rol de los telómeros en envejecimiento celular. Puesto que la maquinaria de replicación no puede replicar completamente el final de los cromosomas, los telómeros se acortan progresivamente con cada división celular, activando eventualmente la senescencia celular. La longitud telomérica (LT) sin lugar a dudas es un marcador importante de las capacidades proliferativas de las células. Muchos estudios han relacionado a la LT con enfermedades como el cáncer, enfermedades coronarias, neurológicas, predisposición a infecciones o el proceso de envejecimiento. La LT puede depender de muchas variables: edad, género, ancestría. No obstante no se tiene claridad de cómo o en qué medida estas variables puedan afectar la longitud de los telómeros de un individuo en particular. Los estudios relacionando todas estas variables son muy escasos, sobre todo para Latinoamérica. El objetivo de nuestro trabajo es determinar con exactitud la longitud de los telómeros de 98 individuos sanos de un promedio de edad de 20.86 años y de un rango de edad 18 a 28 años. El 75.5 % son mujeres. Se incluyeron los individuos basándonos en su genotipo APOE, de los cuales el 21,4 % son portadores del alelo de riesgo ε4 (ε3/ε4) y el 77 % son individuos no portadores (ε3/ε3). Para el gen SLC6A4 se seleccionaron aquellos que fueran homocigotos para la variante L (32,6 %) y heterocigotos L/S (62,2 %). Para la cuantificación de la LT se utilizó un PCR en tiempo real multiplex con la que se amplificó en una misma reacción tanto la región telomérica, como el gen de referencia de copia única albumina. Posterior a una optimización de la prueba donde se seleccionó como Master Mix la HRM sensimix (Bioline), se calculó el ΔΔCt de la reacción a partir del uso de ADN de una línea celular estándar U937 de longitud telomérica conocida (6.3 kb). La LT promedio de la muestra estudiada fue 5,187 Kb. No se encontró ninguna diferencia significativa entre los grupos estudiados (Hombres vs. Mujeres [P>0.05]), (APOE ε3/ε4 vs. APOE ε3/ε3 [P>0.05]), (SLC6A4 L/L vs. SLC6A4 13 L/S [P>0.05). Tampoco se encontró correlación entre la LT y la edad. Este es el primer estudio en Colombia y Latinoamérica que analiza la longitud telomérica en población sana usando PCR en tiempo real multiplex. Palabras claves: Telómeros, Longitud Telomérica, PCR en tiempo Real, Edad, Genero, APOE, SLC6A4. ABSTRACT. The telomeres are DNA structures that protect the chromosome ends from degradation and fusion. Furthermore, they are essential for the maintenance of genomic integrity. Experimental approaches have demonstrated the role of telomeres in cellular aging. Given that the replication complex is unable to replicate completely the chromosome ends, the telomeres shorten progressively with each cellular division. The telomere length (TL) is an important marker of cellular replicative capacities. Several studies have related the telomere length with the risk for diseases such as cancer, cardiovascular or neurological diseases, and infection predisposition or with normal aging. Telomere length can depend on many variables: age, gender, ancestry, rate of cell replication, among others. Nevertheless, it is not clear the real implications of these variables in the telomere length. Studies focused on the relationship of telomere length with these variables are limited in Latinoamérica. The aim of this study was to determine with accuracy the telomere length in 98 healthy young individuals, with a mean age of 20.86 years (range from 18 to 28 years, 75.5 % were women). The individuals were included based on their APOE genotype, 22% were APOE ε4 carriers (ε3/ε4) and 77 % were non-carriers individuals. For SLC6A4 genotype, 32.6 % individuals homozygous for the variant L and 62.2 % L/S heterozygous were selected. For measurement of the telomere length, it was used a Multiplex Real Time PCR, with this technique it was possible to amplify in the same reaction the telomere region as well as the single copy gene (albumin). After an optimization process, it was selected the Master Mix HRM sensimix (Bioline) and it was calculated the ΔΔCt, using as standard DNA from the cell line U937 (known telomere length of 6.3 kb). The mean TL in the samples studied was 5.187 kb. No significant differences were found between the groups studied (Men vs. Women [P>0.05]), (APOE ε3/ε4 vs. APOE ε3/ε3 [P>0.05]), (SLC6A4 L/L vs. SLC6A4 L/S [P>0.05). In addition, no statistically significant correlation was found between TL and age. This is the first study in Colombia and Latin America that analyze telomere length in a healthy population, using multiplex real-time PCR. Keywords: Telomeres, Telomere Length, Real Time PCR, Age, Gender, APOE, SLC6A4.application/pdfSpeck Hernández, Cesar Augusto. Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex. Ibagué : Universidad del Tolima,2013. <http://repository.ut.edu.co/handle/001/1085>T 0701 239 CD3384CD3384https://repository.ut.edu.co/handle/001/1085spaIbague : Universidad del Tolima, 2013.Atribución-NoComercial-CompartirIgual 2.5 Colombia (CCBY-NC-SA 2.5 CO)http://www.creativecommons.org/licenses by-nc/2.5/co/http://purl.org/coar/access_right/c_abf2TelómerosLongitud TeloméricaPCR en tiempo realEdadGéneroAPOESLC6A4TelomeresTelomere LengthReal Time PCRAgeGenderAPOESLC6A4Facultad de Ciencias, Programa de BiologíaForero, Diego A. (Director)PregradoBiólogoCuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplexTrabajo de grado - PregradoTextinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttp://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fPublicationORIGINALRIUT-AAA-spa-2013-Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex.pdfRIUT-AAA-spa-2013-Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex.pdfapplication/pdf2336049https://repository.ut.edu.co/bitstreams/ace30dd6-5810-4ab0-b174-1e74ca06852f/download66f915de370273370a2afc92eedce8baMD51RIUT-AAA-spa-2013-Speck Hernández, Cesar Augusto.pdfRIUT-AAA-spa-2013-Speck Hernández, Cesar Augusto.pdfapplication/pdf231006https://repository.ut.edu.co/bitstreams/6b3107d7-e574-4c0d-88a1-c6e0b92da032/downloadbe6f97895c07009e728076cb3f114b05MD56CC-LICENSElicense_urllicense_urltext/plain; charset=utf-849https://repository.ut.edu.co/bitstreams/06edc2b3-b5d1-42b7-9f57-29a2875d871c/download4afdbb8c545fd630ea7db775da747b2fMD52license_textlicense_texttext/html; charset=utf-821936https://repository.ut.edu.co/bitstreams/9c3ef3cf-3a2b-448b-84d7-9a8ced0c9f8c/download9833653f73f7853880c94a6fead477b1MD53license_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-823148https://repository.ut.edu.co/bitstreams/d47e961a-98d7-4776-8739-3479b688a440/download9da0b6dfac957114c6a7714714b86306MD54LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-8227https://repository.ut.edu.co/bitstreams/bbebf9fb-9361-421b-98fd-50a778cce319/download127f1942dfbe07f43e8227b660620c70MD55TEXTRIUT-AAA-spa-2013-Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex.pdf.txtRIUT-AAA-spa-2013-Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex.pdf.txtExtracted texttext/plain133348https://repository.ut.edu.co/bitstreams/18f131ed-6497-421d-874d-8dc69f968e37/downloadd071008e817c8d6b5d3e1704e0297b16MD57RIUT-AAA-spa-2013-Speck Hernández, Cesar Augusto.pdf.txtRIUT-AAA-spa-2013-Speck Hernández, Cesar Augusto.pdf.txtExtracted texttext/plain3809https://repository.ut.edu.co/bitstreams/ef8b7bb5-7768-46d1-9a0a-419032da7a5b/download4c500b1c4549ca9c549060db141d95e3MD58THUMBNAILRIUT-AAA-spa-2013-Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex.pdf.jpgRIUT-AAA-spa-2013-Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg6533https://repository.ut.edu.co/bitstreams/ec3502f6-476b-4ffb-b906-c69add509564/downloadfeeff3fd96bac9232227eb2bff50d3c0MD59RIUT-AAA-spa-2013-Speck Hernández, Cesar Augusto.pdf.jpgRIUT-AAA-spa-2013-Speck Hernández, Cesar Augusto.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg15825https://repository.ut.edu.co/bitstreams/8bc1fbed-2cdf-4c17-b5b6-d873a70415c2/download98aa6a77a40c5578f1da15e964cb3503MD510001/1085oai:repository.ut.edu.co:001/10852023-03-24 17:38:33.302http://www.creativecommons.org/licenses by-nc/2.5/co/Atribución-NoComercial-CompartirIgual 2.5 Colombia (CCBY-NC-SA 2.5 CO)https://repository.ut.edu.coRepositorio Institucional - Universidad del Tolimasoporte@metabiblioteca.comQ3JlYXRpdmUgQ29tbW9ucyAtIExpY2VuY2lhIGRlIFJlY29ub2NpbWllbnRvIC0gTm9Db21lcmNpYWwgKGJ5LW5jKSA6IFNlIHBlcm1pdGUgbGEgZ2VuZXJhY2nDs24gZGUgb2JyYXMgZGVyaXZhZGFzIHNpZW1wcmUgcXVlIG5vIHNlIGhhZ2EgdW4gdXNvIGNvbWVyY2lhbC4gVGFtcG9jbyBzZSBwdWVkZSB1dGlsaXphciBsYSBvYnJhIG9yaWdpbmFsIGNvbiBmaW5hbGlkYWRlcyBjb21lcmNpYWxlcy4= |