Polimorfismos en el gen cry1B en bacillus thuringiensis (2011)
Se estandarizó la técnica LSSP-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con un único oligonucleótido en condiciones de baja astringencia), para identificar polimorfismos del gen cry1B en aislamientos nativos de Bacillus thuringiensis para utilizarlos como una alternativa en el control biológico del insecto plaga Spodoptera frugiperda. Con este propósito se diseñó un par de oligonucleótidos específicos que amplifican una región variable del gen cry1B de B. thuringiensis. Previamente, se identificó el gen cry1 por PCR en el 43% de 164 aislamientos nativos provenientes del Centro y Caribe Colombiano y el gen cry1B en el 16% de estos (11). Los fragmentos amplificados del gen cry1B de los 11 aislamientos junto con el de la cepa de referencia, B. thuringiensis subsp. aizawai HD137, se analizaron por LSSP-PCR y los patrones electroforéticos obtenidos se compararon cualitativamente, utilizando el programa ImageJ. Con este análisis, y empleando el coeficiente de similitud de Dice se construyó un dendrograma mediante el algoritmo UPGMA. El dendrograma construido de la LSSP-PCR con el oligonucleótido directo mostró tres agrupaciones que diferían en el porcentaje de similaridad, 83, 79 y 68%, constituída esta ultima agrupación por el aislamiento nativo BtGC120 que presentó el patrón de bandas mas diferente y variable. Con el oligonucleótido reverso se presentó una respuesta similar en la que el aislamiento BtGC120 mostró la menor similaridad (43%). Este fragmento del gen cry1B, candidato a nuevo gen, se secuenció y esta lectura nucleótidica de 806 pares de bases se comparó con la base de datos GenBank utilizando el programa BLASTN, evidenciándose una similitud de 93% con la secuencia nucleótidica de los genes cry1Bc1 de B. thuringiensis morrisoni. Posteriormente, utilizando el programa ORF Finder de NCBI se determinó que el marco de lectura +3 predecía una proteína de 268 residuos aminoácidicos, la que al compararla contra la base de datos de proteínas que se encuentra en NCBI utilizando el programa Blast-X se obtuvo el mayor porcentaje de identidad, 88% y de positividad, 92% con la proteína Cry1Bc. El alineamiento de la secuencia nucleótidica del candidato a nuevo gen cry1B del aislamiento BtGC120 con la secuencia del gen cry1Ba1, de la cepa de referencia B. thuringiensis subsp. aizawai, utilizando el programa ClustalW mostró 148 cambios representadas por 5 delecciones, 134 cambios de bases (70 transversiones y 64 transiciones) y 9 inserciones. Después, se confirmaron estos datos mediante la búsqueda de dominios conservados en la secuencia de aminoácidos predicha del gen cry1B de BtGC120, utilizando la base de datos CDD en NCBI y se encontró que esta parte 9 de la proteína esta compuesta por dos dominios, una endotoxina N y una M en mayor proporción. Estos dominios se encuentran conservados en el extremo N-terminal de las proteínas Cry de B. thuringiensis. La endotoxina N esta implicada en la formación del poro y la endotoxina M en el proceso de reconocimiento del receptor, resultados que validan y apoyan la identificación de una proteína Cry con actividad insecticida. Por último, un extracto crudo del aislamiento BtGC120 se evaluó biológicamente contra larvas de primer instar del insecto plaga Spodoptera frugiperda, determinándose una concentración letal de 1,896 ng de proteína total por cm2, concluyéndose que esta cepa bacteriana representa una alternativa para el control de esta plaga. Los resultados obtenidos muestran que la LSSP-PCR es una técnica que permite identificar de una manera específica, variantes de las secuencias de los genes cry de Bt, con potencialidad de encontrar nuevos genes con novedosas actividades biológicas. Es posible implementar esta técnica para evaluar grandes colecciones de aislamientos nativos de B. thuringiensis en tiempos muy cortos.