Estandarización cualitativa de un protocolo de sonicación para la extracción de la enzima Pfu polimerasa en Escherichia Coli BL21-DE3 y su potencial uso en la investigación de nuevos fármacos contra la enfermedad de Alzheimer

En este proyecto se desarrolló una estandarización de un protocolo de sonicación para la extracción de la enzima Pfu polimerasa producida en la cepa de Escherichia coli BL21-DE3, con el objetivo de que esta enzima pueda ser posteriormente utilizada en un proyecto de desarrollo de una biofábrica prod...

Full description

Autores:
Galindo Villanueva, Dahiana
Tipo de recurso:
Trabajo de grado de pregrado
Fecha de publicación:
2023
Institución:
Universidad de Ibagué
Repositorio:
Repositorio Universidad de Ibagué
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repositorio.unibague.edu.co:20.500.12313/3857
Acceso en línea:
https://hdl.handle.net/20.500.12313/3857
Palabra clave:
Alzheimer - Farmácos
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description En este proyecto se desarrolló una estandarización de un protocolo de sonicación para la extracción de la enzima Pfu polimerasa producida en la cepa de Escherichia coli BL21-DE3, con el objetivo de que esta enzima pueda ser posteriormente utilizada en un proyecto de desarrollo de una biofábrica productora de galantamina para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Para ello se generaron cultivos de bacterias E. coli BL21 (DE3) transformadas con el plásmido pET 16B-Pfu que posteriormente fueron inducidas mediante IPTG 1 mM. La expresión de la proteína fue verificada a través de electroforesis SDS-PAGE. La estandarización de extracción de proteínas se realizó a través de un proceso por sonicación en el que se evaluaron diferentes amplitudes de onda: 20%, 30%, 45%, 60% y 70% y resuspendiendo las células en buffer PBS. Se obtuvo mayor cantidad de Pfu, a partir del sobrenadante del cultivo inducido con IPTG y extraída con sonicación a un 45% y a un 70% de amplitud de onda. Se realizó también un control de viabilidad de las bacterias como indicador de la eficiencia de sonicación, el cual indicó que, bajo todas las amplitudes evaluadas, estas no se lisaban completamente. Con base en análisis de literatura se sugiere complementar el protocolo haciendo uso de un buffer específico para lisis con detergentes y o enzimas que contribuyan a la eficiente extracción de proteínas durante el proceso de sonicación, y aumentar la duración de los pulsos a las condiciones de amplitud encontradas como mejores.
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La estandarización de extracción de proteínas se realizó a través de un proceso por sonicación en el que se evaluaron diferentes amplitudes de onda: 20%, 30%, 45%, 60% y 70% y resuspendiendo las células en buffer PBS. Se obtuvo mayor cantidad de Pfu, a partir del sobrenadante del cultivo inducido con IPTG y extraída con sonicación a un 45% y a un 70% de amplitud de onda. Se realizó también un control de viabilidad de las bacterias como indicador de la eficiencia de sonicación, el cual indicó que, bajo todas las amplitudes evaluadas, estas no se lisaban completamente. Con base en análisis de literatura se sugiere complementar el protocolo haciendo uso de un buffer específico para lisis con detergentes y o enzimas que contribuyan a la eficiente extracción de proteínas durante el proceso de sonicación, y aumentar la duración de los pulsos a las condiciones de amplitud encontradas como mejores.In this project, a standardization of a sonication protocol was developed for the extraction of the Pfu polymerase enzyme produced in Escherichia coli strain BL21-DE3, with the aim that this enzyme could be subsequently used in a project to develop a biofactory for the production of galantamine for the treatment of Alzheimer's disease. For this purpose, cultures of E. coli BL21 (DE3) bacteria transformed with the pET 16B-Pfu plasmid were generated and subsequently induced by 1 mM IPTG. Protein expression was verified by SDS-PAGE electrophoresis. The standardization of protein extraction was performed through a sonication process in which different wave amplitudes were evaluated: 20%, 30%, 45%, 60% and 70% and resuspending the cells in PBS buffer. A higher amount of Pfu was obtained from the supernatant of the culture induced with IPTG and extracted with sonication at 45% and 70% wave amplitude. A bacterial viability control was also performed as an indicator of sonication efficiency, which indicated that, under all the amplitudes evaluated, the bacteria were not completely lysed. Based on literature analysis, it is suggested to complement the protocol by using a specific buffer for lysis with detergents and/or enzymes that contribute to the efficient extraction of proteins during the sonication process, and to increase the duration of the pulses at the amplitude conditions found.PregradoBiologo AmbientalAGRADECIMIENTOS 3 RESUMEN 7 Palabras clave: 7 ASBTRACT 8 Key words: 8 INTRODUCCIÓN 9 1. OBJETIVOS 13 2. ESTADO DEL ARTE 13 2.1. Plásmidos y su aplicación en clonaje 14 2.1.3. Expresión de proteínas recombinantes 17 3. METODOLOGÍA 24 3.1. Reactivos 24 3.2. Extracción y verificación del plásmido pET 16B.Pfu 25 3.3. Transformación del plásmido pET 16B.Pfu en E. coli BL21-DE3 25 3.4. Inducción de la expresión de Pfu 26 3.5. Extracción de proteínas totales por sonicación 27 3.6. Control de la eficiencia de sonicación 27 3.7. Verificación de las extracciones de proteínas 27 4. RESULTADOS 29 4.1. Plásmido pET 16B.Pfu de E. coli DH5α 29 4.2. Transformación del plásmido pET 16B.Pfu en E. coli BL21-DE3 30 4.3. Verificación de la eficiencia de sonicación 30 4.4. Efecto de la amplitud de onda en la extracción de proteínas del cultivo de E. coli BL21-DE3 pET 16B-Pfu 31 5. DISCUSIÓN 34 6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 39 REFERENCIAS 41 ANEXOS 5154 páginasapplication/pdfGalindo, D. (2023). Estandarización cualitativa de un protocolo de sonicación para la extracción de la enzima Pfu polimerasa en Escherichia Coli BL21-DE3 y su potencial uso en la investigación de nuevos fármacos contra la enfermedad de Alzheimer. [Trabajo de grado, Universidad de Ibagué]. https://hdl.handle.net/20.500.12313/3857https://hdl.handle.net/20.500.12313/3857spaUniversidad de los Andes, Universidad de Ibagué, MSc Jaime David Vega PáezCiencias Naturales y MatemáticasIbaguéBiología Ambiental1. Alber, A., Renault, H., Basilio Lopes, A., Bassard, J. É., liu, z., Ullmann, P., . . . Ehltin, J. (2019). Evolución de las 3-hidroxilasas conjugadas de cumaroilo en tierra.Plantas: biosíntesis y defensa de la ligni. The plant journal, 809-1024.2. Alfonso. (2006). Temas de Bacteriologia y Virologia medica. Fefmur.3. Álvarez Martín, P. (2008). Desarrollo y aplicación de sistemas vector/hospedador bifidobacterias.4. Andrade, C. M., Pereira Jr, N., & Antranikian, G. (1999). 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