Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore®
La tecnología de secuenciación de Oxford Nanopore®, caracterizada por permitir obtener secuencias largas y en tiempo real, es una alternativa a otras tecnologías de secuenciación dentro de las tecnologías conocidas como de nueva generación (NGS). Entre los estudios que más han sacado provecho de est...
- Autores:
-
Blanco Casallas, Irene
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2023
- Institución:
- Universidad de los Andes
- Repositorio:
- Séneca: repositorio Uniandes
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.uniandes.edu.co:1992/67938
- Acceso en línea:
- http://hdl.handle.net/1992/67938
- Palabra clave:
- Bactris gasipaes
Hongos endófitos
Metabarcoding
Microbioma
Nanopore®
Biología
- Rights
- openAccess
- License
- Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional
| id |
UNIANDES2_3c0261541742f54b038be16cd166b85e |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.uniandes.edu.co:1992/67938 |
| network_acronym_str |
UNIANDES2 |
| network_name_str |
Séneca: repositorio Uniandes |
| repository_id_str |
|
| dc.title.none.fl_str_mv |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® |
| title |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® |
| spellingShingle |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® Bactris gasipaes Hongos endófitos Metabarcoding Microbioma Nanopore® Biología |
| title_short |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® |
| title_full |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® |
| title_fullStr |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® |
| title_full_unstemmed |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® |
| title_sort |
Los desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore® |
| dc.creator.fl_str_mv |
Blanco Casallas, Irene |
| dc.contributor.advisor.none.fl_str_mv |
Restrepo Restrepo, Silvia Reyes Muñoz, Alejandro |
| dc.contributor.author.none.fl_str_mv |
Blanco Casallas, Irene |
| dc.contributor.researchgroup.es_CO.fl_str_mv |
LAMFU BCEM |
| dc.subject.keyword.none.fl_str_mv |
Bactris gasipaes Hongos endófitos Metabarcoding Microbioma Nanopore® |
| topic |
Bactris gasipaes Hongos endófitos Metabarcoding Microbioma Nanopore® Biología |
| dc.subject.themes.es_CO.fl_str_mv |
Biología |
| description |
La tecnología de secuenciación de Oxford Nanopore®, caracterizada por permitir obtener secuencias largas y en tiempo real, es una alternativa a otras tecnologías de secuenciación dentro de las tecnologías conocidas como de nueva generación (NGS). Entre los estudios que más han sacado provecho de esta tecnología se destacan los análisis metagenómicos por amplicón o de metabarcoding de comunidades microbianas presentes en diversas muestras biológicas. Las comunidades microbianas asociadas a diferentes organismos, o microbioma, tienen un rol fundamental en el desarrollo de su hospedero, por lo que es de gran importancia conocer en detalle su composición. En el presente estudio se analizaron datos provenientes de la investigación de Marbello et al. (2021), donde se utilizó la tecnología de secuenciación de Nanopore para identificar comunidades microbianas asociadas a las hojas de la palma de chontaduro (Bactris gasipaes). El objetivo principal era la asignación y caracterización de las comunidades de hongos endófitos de la planta. El análisis de los datos permitió identificar una alta tasa de error en los datos que limita la precisión en la asignación, algunos amplicones parciales o quiméricos y un grupo significativo de secuencias que correspondía a la planta hospedera. Esto pudo deberse a diferentes factores metodológicos que serán discutidos en este documento. |
| publishDate |
2023 |
| dc.date.accessioned.none.fl_str_mv |
2023-06-27T20:18:39Z |
| dc.date.available.none.fl_str_mv |
2023-06-27T20:18:39Z |
| dc.date.issued.none.fl_str_mv |
2023-06-27 |
| dc.type.es_CO.fl_str_mv |
Trabajo de grado - Pregrado |
| dc.type.driver.none.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/bachelorThesis |
| dc.type.version.none.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| dc.type.coar.none.fl_str_mv |
http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f |
| dc.type.content.es_CO.fl_str_mv |
Text |
| dc.type.redcol.none.fl_str_mv |
http://purl.org/redcol/resource_type/TP |
| format |
http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f |
| status_str |
acceptedVersion |
| dc.identifier.uri.none.fl_str_mv |
http://hdl.handle.net/1992/67938 |
| dc.identifier.instname.es_CO.fl_str_mv |
instname:Universidad de los Andes |
| dc.identifier.reponame.es_CO.fl_str_mv |
reponame:Repositorio Institucional Séneca |
| dc.identifier.repourl.es_CO.fl_str_mv |
repourl:https://repositorio.uniandes.edu.co/ |
| url |
http://hdl.handle.net/1992/67938 |
| identifier_str_mv |
instname:Universidad de los Andes reponame:Repositorio Institucional Séneca repourl:https://repositorio.uniandes.edu.co/ |
| dc.language.iso.es_CO.fl_str_mv |
spa |
| language |
spa |
| dc.relation.references.es_CO.fl_str_mv |
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of molecular biology, 215(3), 403-410. Andrews, S. (2010). FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data [Online]. Bengtsson-Palme, J., Ryberg, M., Hartmann, M., Branco, S., Wang, Z., Godhe, A., ... & Nilsson, R. H. (2013). Improved software detection and extraction of ITS1 and ITS 2 from ribosomal ITS sequences of fungi and other eukaryotes for analysis of environmental sequencing data. Methods in ecology and evolution, 4(10), 914-919. Bonenfant, Q., Noé, L., & Touzet, H. (2023). Porechop_ABI: discovering unknown adapters in Oxford Nanopore Technology sequencing reads for downstream trimming. Bioinformatics Advances. D'Andreano, S., Cuscó, A., & Francino, O. (2020). Rapid and real-time identification of fungi up to species level with long amplicon nanopore sequencing from clinical samples. Biology Methods and Protocols, 6(1), bpaa026. Dumschott, K., Schmidt, M. H., Chawla, H. S., Snowdon, R., & Usadel, B. (2020). Oxford Nanopore sequencing: new opportunities for plant genomics?. Journal of Experimental Botany, 71(18), 5313-5322. Kerkhof, L. J. (2021). Is Oxford Nanopore sequencing ready for analyzing complex microbiomes?. FEMS microbiology ecology, 97(3), fiab001. Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L., & Pace, N. R. (1985). Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences, 82(20), 6955-6959. Larsson, A. (2014). AliView: a fast and lightweight alignment viewer and editor for large datasets. Bioinformatics, 30(22), 3276-3278. Leger, A., & Leonardi, T. (2019). PycoQC, interactive quality control for Oxford Nanopore Sequencing. Journal of Open-Source Software, 4(34), 1236, https://doi.org/10.21105/joss.01236 Li, H. (2018). Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics, 34(18), 3094-3100. MacKenzie, M., & Argyropoulos, C. (2023). An Introduction to Nanopore Sequencing: Past, Present, and Future Considerations. Marbello, A., Díaz, H. C., Guevara-Suárez, M., Jiménez, P., Rodríguez, M. J., Bolaños, N., Cárdenas, M., Restrepo, S. (2021). Microbial communities associated with peach palm (Bactris gasipaes) [Master's thesis]. Universidad de Los Andes, Bogotá, Colombia. Nilsson, R. H., Ryberg, M., Kristiansson, E., Abarenkov, K., Larsson, K. H., & Kõljalg, U. (2006). Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases: a fungal perspective. PloS one, 1(1), e59. Santos, A., van Aerle, R., Barrientos, L., & Martinez-Urtaza, J. (2020). Computational methods for 16S metabarcoding studies using Nanopore sequencing data. Computational and Structural Biotechnology Journal, 18, 296-305. Shen, W., Le, S., Li, Y., & Hu, F. (2016). SeqKit: a cross-platform and ultrafast toolkit for FASTA/Q file manipulation. PloS one, 11(10), e0163962. Wang, Y., Zhao, Y., Bollas, A., Wang, Y., & Au, K. F. (2021). Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature biotechnology, 39(11), 1348-1365. Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., & Riyaz-Ul-Hassan, S. (2015). Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied microbiology and biotechnology, 99, 2955-2965. Wick, R. R., Judd, L. M., & Holt, K. E. (2019). Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome biology, 20, 1-10. Xu, J. (2016). Fungal DNA barcoding. Genome, 59(11), 913-932. Zhou, A., Lin, T., & Xing, J. (2019). Evaluating nanopore sequencing data processing pipelines for structural variation identification. Genome biology, 20, 1-13. |
| dc.rights.license.spa.fl_str_mv |
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional |
| dc.rights.uri.*.fl_str_mv |
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
| dc.rights.accessrights.spa.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
| dc.rights.coar.spa.fl_str_mv |
http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
| rights_invalid_str_mv |
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| dc.format.extent.es_CO.fl_str_mv |
18 páginas |
| dc.format.mimetype.es_CO.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.publisher.es_CO.fl_str_mv |
Universidad de los Andes |
| dc.publisher.program.es_CO.fl_str_mv |
Biología |
| dc.publisher.faculty.es_CO.fl_str_mv |
Facultad de Ciencias |
| dc.publisher.department.es_CO.fl_str_mv |
Departamento de Ciencias Biológicas |
| institution |
Universidad de los Andes |
| bitstream.url.fl_str_mv |
https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/8e438617-b7d3-4d66-8f00-e685fe524ab2/download https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/e720fb38-dc57-47ad-9efb-bf3d8fe34b99/download https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/5504d283-c667-4457-bac2-690f3a974a5b/download https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/b6401bf0-d52f-4938-bb8a-63dd929ed88a/download https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/71e38f86-7d63-4732-9a9b-75edf2ab5217/download https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/3ea33848-97bc-4983-adca-7301405853ec/download https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/5c16a5e5-7d10-4860-9671-108dc1ab626a/download https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/0f5bd221-843a-4d82-bf63-63f7651f912a/download |
| bitstream.checksum.fl_str_mv |
9cf8249fb46b68539b9e860d323a0c31 3d1de329e99474b1d1ba4e1f02be0687 4460e5956bc1d1639be9ae6146a50347 5aa5c691a1ffe97abd12c2966efcb8d6 33323e494b4a9360ab1edc42fe81c6a7 70a51dcd618a6d1cd20a8dd6c2e88cdb d1e6f6170ca1efad09f1f1a7c6bbe85e d626dc0e4985daf9a7c3c8a1ea160d54 |
| bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv |
MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 |
| repository.name.fl_str_mv |
Repositorio institucional Séneca |
| repository.mail.fl_str_mv |
adminrepositorio@uniandes.edu.co |
| _version_ |
1812134007918297088 |
| spelling |
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Restrepo Restrepo, Silviavirtual::13124-1Reyes Muñoz, Alejandrovirtual::13125-1Blanco Casallas, Irene93b023c3-f5d6-47a2-b4f4-f05d490677af600LAMFUBCEM2023-06-27T20:18:39Z2023-06-27T20:18:39Z2023-06-27http://hdl.handle.net/1992/67938instname:Universidad de los Andesreponame:Repositorio Institucional Sénecarepourl:https://repositorio.uniandes.edu.co/La tecnología de secuenciación de Oxford Nanopore®, caracterizada por permitir obtener secuencias largas y en tiempo real, es una alternativa a otras tecnologías de secuenciación dentro de las tecnologías conocidas como de nueva generación (NGS). Entre los estudios que más han sacado provecho de esta tecnología se destacan los análisis metagenómicos por amplicón o de metabarcoding de comunidades microbianas presentes en diversas muestras biológicas. Las comunidades microbianas asociadas a diferentes organismos, o microbioma, tienen un rol fundamental en el desarrollo de su hospedero, por lo que es de gran importancia conocer en detalle su composición. En el presente estudio se analizaron datos provenientes de la investigación de Marbello et al. (2021), donde se utilizó la tecnología de secuenciación de Nanopore para identificar comunidades microbianas asociadas a las hojas de la palma de chontaduro (Bactris gasipaes). El objetivo principal era la asignación y caracterización de las comunidades de hongos endófitos de la planta. El análisis de los datos permitió identificar una alta tasa de error en los datos que limita la precisión en la asignación, algunos amplicones parciales o quiméricos y un grupo significativo de secuencias que correspondía a la planta hospedera. Esto pudo deberse a diferentes factores metodológicos que serán discutidos en este documento.BiólogoPregrado18 páginasapplication/pdfspaUniversidad de los AndesBiologíaFacultad de CienciasDepartamento de Ciencias BiológicasLos desafíos de analizar datos de metabarcoding provenientes de secuenciación con Oxford Nanopore®Trabajo de grado - Pregradoinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TPBactris gasipaesHongos endófitosMetabarcodingMicrobiomaNanopore®BiologíaAltschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of molecular biology, 215(3), 403-410.Andrews, S. (2010). FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data [Online].Bengtsson-Palme, J., Ryberg, M., Hartmann, M., Branco, S., Wang, Z., Godhe, A., ... & Nilsson, R. H. (2013). Improved software detection and extraction of ITS1 and ITS 2 from ribosomal ITS sequences of fungi and other eukaryotes for analysis of environmental sequencing data. Methods in ecology and evolution, 4(10), 914-919.Bonenfant, Q., Noé, L., & Touzet, H. (2023). Porechop_ABI: discovering unknown adapters in Oxford Nanopore Technology sequencing reads for downstream trimming. Bioinformatics Advances.D'Andreano, S., Cuscó, A., & Francino, O. (2020). Rapid and real-time identification of fungi up to species level with long amplicon nanopore sequencing from clinical samples. Biology Methods and Protocols, 6(1), bpaa026.Dumschott, K., Schmidt, M. H., Chawla, H. S., Snowdon, R., & Usadel, B. (2020). Oxford Nanopore sequencing: new opportunities for plant genomics?. Journal of Experimental Botany, 71(18), 5313-5322.Kerkhof, L. J. (2021). Is Oxford Nanopore sequencing ready for analyzing complex microbiomes?. FEMS microbiology ecology, 97(3), fiab001.Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L., & Pace, N. R. (1985). Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences, 82(20), 6955-6959.Larsson, A. (2014). AliView: a fast and lightweight alignment viewer and editor for large datasets. Bioinformatics, 30(22), 3276-3278.Leger, A., & Leonardi, T. (2019). PycoQC, interactive quality control for Oxford Nanopore Sequencing. Journal of Open-Source Software, 4(34), 1236, https://doi.org/10.21105/joss.01236Li, H. (2018). Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics, 34(18), 3094-3100.MacKenzie, M., & Argyropoulos, C. (2023). An Introduction to Nanopore Sequencing: Past, Present, and Future Considerations.Marbello, A., Díaz, H. C., Guevara-Suárez, M., Jiménez, P., Rodríguez, M. J., Bolaños, N., Cárdenas, M., Restrepo, S. (2021). Microbial communities associated with peach palm (Bactris gasipaes) [Master's thesis]. Universidad de Los Andes, Bogotá, Colombia.Nilsson, R. H., Ryberg, M., Kristiansson, E., Abarenkov, K., Larsson, K. H., & Kõljalg, U. (2006). Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases: a fungal perspective. PloS one, 1(1), e59.Santos, A., van Aerle, R., Barrientos, L., & Martinez-Urtaza, J. (2020). Computational methods for 16S metabarcoding studies using Nanopore sequencing data. Computational and Structural Biotechnology Journal, 18, 296-305.Shen, W., Le, S., Li, Y., & Hu, F. (2016). SeqKit: a cross-platform and ultrafast toolkit for FASTA/Q file manipulation. PloS one, 11(10), e0163962.Wang, Y., Zhao, Y., Bollas, A., Wang, Y., & Au, K. F. (2021). Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature biotechnology, 39(11), 1348-1365.Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., & Riyaz-Ul-Hassan, S. (2015). Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied microbiology and biotechnology, 99, 2955-2965.Wick, R. R., Judd, L. M., & Holt, K. E. (2019). Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome biology, 20, 1-10.Xu, J. (2016). Fungal DNA barcoding. Genome, 59(11), 913-932.Zhou, A., Lin, T., & Xing, J. (2019). Evaluating nanopore sequencing data processing pipelines for structural variation identification. Genome biology, 20, 1-13.201812844Publicationhttps://scholar.google.es/citations?user=7_dVIeAAAAAJvirtual::13124-1https://scholar.google.es/citations?user=hbXF8UEAAAAJvirtual::13125-10000-0001-9016-1040virtual::13124-10000-0003-2907-3265virtual::13125-1https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0000468800virtual::13124-1https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0000395927virtual::13125-1d7d594d1-aae9-471e-be1d-fc6bbcabef5cvirtual::13124-1f71489e5-69f6-4e6b-90a6-c6b1d3fecec7virtual::13125-1d7d594d1-aae9-471e-be1d-fc6bbcabef5cvirtual::13124-1f71489e5-69f6-4e6b-90a6-c6b1d3fecec7virtual::13125-1ORIGINALDocumentoTesisIreneBlanco.pdfDocumentoTesisIreneBlanco.pdfTrabajo de gradoapplication/pdf3525898https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/8e438617-b7d3-4d66-8f00-e685fe524ab2/download9cf8249fb46b68539b9e860d323a0c31MD53201812844_ForAutEntTesis_TraGraSisBib_202320.pdf201812844_ForAutEntTesis_TraGraSisBib_202320.pdfHIDEapplication/pdf418723https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/e720fb38-dc57-47ad-9efb-bf3d8fe34b99/download3d1de329e99474b1d1ba4e1f02be0687MD54CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8805https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/5504d283-c667-4457-bac2-690f3a974a5b/download4460e5956bc1d1639be9ae6146a50347MD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81810https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/b6401bf0-d52f-4938-bb8a-63dd929ed88a/download5aa5c691a1ffe97abd12c2966efcb8d6MD51TEXTDocumentoTesisIreneBlanco.pdf.txtDocumentoTesisIreneBlanco.pdf.txtExtracted texttext/plain28142https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/71e38f86-7d63-4732-9a9b-75edf2ab5217/download33323e494b4a9360ab1edc42fe81c6a7MD55201812844_ForAutEntTesis_TraGraSisBib_202320.pdf.txt201812844_ForAutEntTesis_TraGraSisBib_202320.pdf.txtExtracted texttext/plain1186https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/3ea33848-97bc-4983-adca-7301405853ec/download70a51dcd618a6d1cd20a8dd6c2e88cdbMD57THUMBNAILDocumentoTesisIreneBlanco.pdf.jpgDocumentoTesisIreneBlanco.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg6839https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/5c16a5e5-7d10-4860-9671-108dc1ab626a/downloadd1e6f6170ca1efad09f1f1a7c6bbe85eMD56201812844_ForAutEntTesis_TraGraSisBib_202320.pdf.jpg201812844_ForAutEntTesis_TraGraSisBib_202320.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg15958https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstreams/0f5bd221-843a-4d82-bf63-63f7651f912a/downloadd626dc0e4985daf9a7c3c8a1ea160d54MD581992/67938oai:repositorio.uniandes.edu.co:1992/679382024-03-13 14:51:38.72http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/open.accesshttps://repositorio.uniandes.edu.coRepositorio institucional Sénecaadminrepositorio@uniandes.edu.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 |