Expresión del extremo 5´ del gen E1 del virus chikungunya en escherichia coli

El virus Chikungunya (CHIKV) es un alfavirus de la familia Togaviridae, agente causante de la fiebre del Chikungunya, enfermedad que ha afectado a más de un millón de personas en el continente americano en los últimos tres años. Aunque la enfermedad causada por el virus no se considera como grave y rara vez es fatal; si es incapacitante y puede comprometer diversos órganos. Además, en cada brote epidémico se describen nuevas y más severas manifestaciones a largo plazo; la artralgia prolongada por meses e incluso años, es una de las complicaciones reportadas con mayor frecuencia. Dado que la introducción de CHIKV en Colombia es reciente (2014), los virus causantes de ese primer brote epidémico aún no han sido caracterizados y que la investigación en el país muy escasa, el laboratorio de Virología de la Universidad El Bosque ha abordado el estudio de la patogénesis y caracterización del virus CHIKV circulante en el país, para lo cual se requiere de la generación de herramientas celulares (modelo de infección in vitro); moleculares (proteínas recombinantes) e inmunológicas (anticuerpos específicos contra proteínas virales). El objetivo principal de este trabajo es expresar el extremo 5´del gen E1 con el fin de generar un inmunógeno para la obtención de anticuerpos policlonales que permitan detectar la infección por CHIKV in vitro. Esta detección se pretende principalmente en células involucradas en la patogénesis de la enfermedad como macrófagos derivados de monocitos y células musculares. Para ello, el fragmento correspondiente al extremo 5´del gen E1 que se encuentra en la región comprendida entre el nucleótido 3 y el 603 del gen E1, se amplificó por PCR a partir de ADN complementario y oligonucleótidos específicos. Después de la purificación del fragmento correspondiente al extremo 5´del gen E1, se insertó en el vector de expresión PinPoint™Xa-2 el cual fue utilizado para transformar bacterias de la cepa TOP10 y obtener un clon. El plásmido recombinante PinPoint™Xa-2-E1 fue propagado y utilizado para transformar tres cepas de Escherichia coli: BL21® y sus derivadas CodonPlus RIL® y RosettaTM. En clones de cada una de estas tres cepas, anteriormente obtenidas se indujo la expresión de la proteína E1 y se observó que la proteína de fusión o E1 biotinilada de 38 kDa sólo se sintetizó en la cepa Rosetta™. Ensayos de solubilidad de la proteína E1 producida por esta cepa, permitieron establecer que la proteína recombinante es insoluble en condiciones nativas pero puede ser solubilizada en presencia de concentraciones bajas de SDS (0.25%). Por último, se realizó un ensayo preliminar de purificación por cromatografía de afinidad con una resina de avidina; la presencia de la proteína en la fracción de proteínas no unidas y en los lavados mostró que la proteína no fue retenida por el ligando de afinidad. Aunque se logró la expresión del fragmento de 600 pb del gen E1 correspondiente al extremo 5´en una cepa de E.coli, es necesario modificar algunas condiciones en la cromatografía de afinidad y/o explorar otras estrategias de purificación que conduzcan a la obtención de una fracción enriquecida o parcialmente pura de la proteína recombinante.

• Autores: Correal Espinosa, María Camila
• Tipo de recurso: Trabajo de grado de pregrado
• Fecha de publicación: 2017
• Institución: Universidad El Bosque
• Repositorio: Repositorio U. El Bosque
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unbosque.edu.co:20.500.12495/8223
• Acceso en línea: http://hdl.handle.net/20.500.12495/8223
• Palabra clave: Chikungunya; Proteína E1; Proteínas recombinantes; Clonación; Escherichia coli; 570; Chikungunya; Recombinant proteins; Protein E1; Cloning; BL21 strain
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