Producción, purificación y evaluación catalítica de una Taq ADN polimerasa recombinante
La Taq ADN polimerasa es una enzima utilizada en la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y sus variantes. En este trabajo, se llevó a cabo la producción, purificación y evaluación funcional de una Taq polimerasa recombinante (r_TaqDNA-pol) mediante un sistema de expresión heterólogo...
- Autores:
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Torres Hichster, Luna Isabella
- Tipo de recurso:
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- Fecha de publicación:
- 2025
- Institución:
- Universidad El Bosque
- Repositorio:
- Repositorio U. El Bosque
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La Taq ADN polimerasa es una enzima utilizada en la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y sus variantes. En este trabajo, se llevó a cabo la producción, purificación y evaluación funcional de una Taq polimerasa recombinante (r_TaqDNA-pol) mediante un sistema de expresión heterólogo en Escherichia coli BL21(DE3), utilizando el plásmido pOpenTaq. Se estandarizaron las condiciones óptimas de inducción con IPTG, temperatura de cultivo y tiempos de incubación, a fin de maximizar la expresión soluble de la enzima. La Taq polimerasa recombinante fue purificada mediante un protocolo que aprovecha su termoestabilidad, seguido de precipitación salina y cromatografía de exclusión molecular, obteniendo un producto con alta pureza. Este protocolo fue diseñado en el marco del presente trabajo como una propuesta metodológica original para la purificación eficiente de la enzima recombinante. La funcionalidad de la r_TaqDNA-pol fue confirmada mediante ensayos de PCR dirigidos a genes de interés, demostrando una eficacia comparable a la enzima comercial. Adicionalmente, se evaluó la sensibilidad, la termoestabilidad y la dilución funcional mínima de la enzima recombinante, consolidando su utilidad en contextos experimentales diversos. Estos resultados respaldan el uso de sistemas de expresión bacterianos como alternativa viable para la producción nacional de enzimas de uso crítico, reduciendo la dependencia de importaciones y garantizando el suministro de insumos claves para proyectos estratégicos de investigación biomédica. |
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La Taq polimerasa recombinante fue purificada mediante un protocolo que aprovecha su termoestabilidad, seguido de precipitación salina y cromatografía de exclusión molecular, obteniendo un producto con alta pureza. Este protocolo fue diseñado en el marco del presente trabajo como una propuesta metodológica original para la purificación eficiente de la enzima recombinante. La funcionalidad de la r_TaqDNA-pol fue confirmada mediante ensayos de PCR dirigidos a genes de interés, demostrando una eficacia comparable a la enzima comercial. Adicionalmente, se evaluó la sensibilidad, la termoestabilidad y la dilución funcional mínima de la enzima recombinante, consolidando su utilidad en contextos experimentales diversos. Estos resultados respaldan el uso de sistemas de expresión bacterianos como alternativa viable para la producción nacional de enzimas de uso crítico, reduciendo la dependencia de importaciones y garantizando el suministro de insumos claves para proyectos estratégicos de investigación biomédica.BioingenieroPregradoTaq DNA polymerase is a enzyme used in the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique and its variants. In this work, the production, purification, and functional evaluation of a recombinant Taq polymerase (r_TaqDNA-pol) was carried out using a heterologous expression system in Escherichia coli BL21(DE3) using the pOpenTaq plasmid. Optimal induction conditions with IPTG, culture temperature, and incubation times were standardized to maximize soluble expression of the enzyme. The recombinant Taq polymerase was purified using a protocol that takes advantage of its thermostability, followed by salt precipitation and gel-exclusion chromatography, obtaining a highly pure product. This protocol was designed within the framework of this work as an original methodological proposal for the efficient purification of the recombinant enzyme. The functionality of r_TaqDNA-pol was confirmed by PCR assays targeting genes of interest, demonstrating efficacy comparable to that of the commercial enzyme. Additionally, the sensitivity, thermostability, and minimum functional dilution of the recombinant enzyme were evaluated, consolidating its usefulness in diverse experimental contexts. These results support the use of bacterial expression systems as a viable alternative for the domestic production of critically used enzymes, reducing dependence on imports and guaranteeing the supply of key inputs for strategic biomedical research projects.application/pdfAttribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 Internationalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/Acceso abiertohttps://purl.org/coar/access_right/c_abf2http://purl.org/coar/access_right/c_abf2Taq polimerasaPCRProteína recombinantePurificaciónProducciónValidaciónEnzimaE. coli610.28Taq polymerasePCRRecombinant proteinPurificationProductionValidationEnzymeE. coliProducción, purificación y evaluación catalítica de una Taq ADN polimerasa recombinanteProduction, purification, and catalytic evaluation of a recombinant Taq DNA polymeraseBioingenieríaUniversidad El BosqueFacultad de IngenieríaTesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregradohttps://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fhttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1finfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttps://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85Agilent Technologies. (2014). Size exclusion chromatography primer. https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/5991-3651ES.pdfAuken, E., Christiansen, A. V., Jacobsen, B. H., Foged, N., & Sørensen, K. I. (2005). Piecewise 1D. laterally constrained inversion of resistivity data. Geophysical Prospecting, 53(4), 497–506.Bartlett, J. M. S., & Stirling, D. (2003). A short history of the polymerase chain reaction. En PCR Protocols (pp. 3–6). Humana Press.Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1–2), 248–254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3Brenes-Guillén, L. (2019). Kary Mullis: padre de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Revista de Biología Tropical, Blog.Cerna, J., & Guapillo, M. (2014). Taq polimerasa: De los geiseres a la ciencia. UTM. https://www.utm.mx/edi_anteriores/temas54/T54_2Notas2-Taq%20polimerasa%20-%20De%20los%20geisers%20a%20la%20ciencia.pdfChen, S., Zheng, X., Cao, H., Jiang, L., Liu, F., & Sun, X. (2015). A simple and efficient method for extraction of Taq DNA polymerase. Electronic Journal of Biotechnology, 18(5), 343–346.Chien, A., Edgar, D. B., & Trela, J. M. (1976). Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. Journal of Bacteriology.Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W., & Helling, R. B. (1973). Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences, 70(11), 3240–3244. https://doi.org/10.1073/pnas.70.11.3240Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry, 151(2), 369–374. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90284-8Dale, G. E., Broger, C., Hartman, P. G., & Langen, H. (2017). 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