Producción de una Peptidil arginina deiminasa de Porphyromonas gingivalis (PPAD) de manera recombinante

La enzima Peptidil arginina deiminasa producida por P. gingivalis (PPAD) induce la conversión de la arginina en citrulina en proteínas bacterianas y humanas; favoreciendo la producción de anticuerpos contra proteínas citrulinadas. Varios estudios han evaluado la relación entre anticuerpos anti-PPAD y un aumento en la actividad de la artritis reumatoide (AR), aún existe controversia en este aspecto. De ahí la importancia en evaluar la presencia de anti-PPAD en pacientes con AR siendo indispensable la PPAD recombinante como antígeno para evaluar anticuerpos en individuos con AR. Producir una PPAD-NT recombinante. Se diseñaron primers para el fragmento N-terminal, basados en la secuencia de la PPAD almacenada en la base de datos del NCBI. Posteriormente el fragmento N-terminal fue amplificado por PCR y clonado en el plásmido pGEM-R-T para la propagación del inserto, la transformación se realizó en Escherichia coli. Top 10. El inserto se rastreó por PCR, los clones se propagaron y se realizó extracción. Se realizó la restricción del inserto con las enzimas Xbal y Nsil y se clono de nuevo en el plásmido de expresión pET-CT, y se transformó en E.coli BL21. Se realizó el rastreo de clones y se confirmódireccionalidad del inserto por PCR. Posteriormente se indujo la expresión de la proteína con IPTG 1mM evaluada por SDS-PAGE en sobrenadantes y pellets celulares a diferentes tiempos (2, 4, 6 y 18 horas) para confirmar la producción de la proteína. Se confirmó la producción de la PPAD-NT recombinante en los pellets celulares con un fragmento de aproximadamente 25kDa a las dos horas de inducción, no se encontró la proteína en los sobrenadantes, lo que indica que la proteína no se encuentra de manera soluble, lo que requiere de otros métodos para lograr la purificación soluble de la PPAD-T. Se produjo con éxito la PPAD-NT recombinante, aunque de manera insoluble.

• Autores: Castillo Ramírez, Daniela
• Tipo de recurso: Trabajo de grado de pregrado
• Fecha de publicación: 2018
• Institución: Universidad El Bosque
• Repositorio: Repositorio U. El Bosque
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unbosque.edu.co:20.500.12495/2289
• Acceso en línea: http://hdl.handle.net/20.500.12495/2289
• Palabra clave: Diversidad de anticuerpos
• Rights: openAccess
• License: Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International