Evaluacion de la expresion de proteínas en las celulas del cumulo como marcadores de la capacidad de desarrollo del oocito bovino

Para mejorar las tasas de producción in vitro de embriones (PIVE) bovinos es necesario entender los mecanismos moleculares que permiten la adquisición de la competencia oocitaria. Métodos de biología molecular parecen permitir conocer estos mecanismos. Adicionalmente los oocitos han sido seleccionad...

Full description

Autores:: Velez Jaramillo, Isabel Catalina

Tipo de recurso:: Doctoral thesis

Fecha de publicación:: 2018

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

Description
Summary:	Para mejorar las tasas de producción in vitro de embriones (PIVE) bovinos es necesario entender los mecanismos moleculares que permiten la adquisición de la competencia oocitaria. Métodos de biología molecular parecen permitir conocer estos mecanismos. Adicionalmente los oocitos han sido seleccionados para la PIVE según su apariencia morfológica lo cual es subjetivo. El presente trabajo fue realizado para estudiar el efecto de la morfología de los complejos cúmulo-oocito (CCO) Bos indicus en el subsecuente desarrollo de los embriones in vitro y para determinar la expresión proteica de las células el cúmulo (CC) antes y después de la maduración in vitro. Ovarios de hembras B. indicus fueron colectados de un centro de faenado y transportados al laboratorio en solución salina a 30°C. Folículos entre 3-8 mm fueron aspirados manualmente y CCO clasificados como tipo I (TI): ooplasma homogéneo y ≥ 4 capas de CC compactas y tipo II (TII): ooplasma granular y ≥ 4 capas de CC con expansión en las células periférica. CC de 50 CCO fueron colectadas por medio de pipeteo manual y congelados en bicarbonato de amonio y liofilizados para posterior análisis de expresión de proteínas. Otro grupo de CCO fue madurado in vitro en TCM 199 suplementado por 24 h. Después de la maduración in vitro CC de 50 CCO fueron colectadas y procesadas de la misma manera como fue descrito anteriormente. Los CCO restantes fueron fertilizados in vitro con un toro de fertilidad conocida y los presuntos cigotos fueron cultivados in vitro dúrate 7 días. Diez blastocistos fueron teñidos con Hoechst 33342 y el número de blastomeras determinado para conocer la calidad embrionaria entre los grupos. La expresión de proteínas fueron determinadas para los siguientes grupos: CC inmaduras tipo I (TIT0) y tipo II (TIIT0); CC maduradas in vitro tipo I (TIT24) y tipo II (TIIT24). Para la extracción de las proteínas las células fueron sonicadas por 30 min. a 4°C, congeladas en nitrógeno líquido 3 veces y maceradas entre cada congelación. Veinte µg de proteína total para cada grupo fueron puestos en gel de SDS-PAGE y las proteínas fueron identificadas usando ESI-MS/MS. Diferencias en clivaje, tasa de embriones y número de blastomeras fue determinado usando la prueba t. Para determinar la diferencia en la expresión de proteínas se calculó un promedio para cada proteína utilizando los 5 picos más intensos de los péptidos identificados en la espectrometría de masa. La diferencia entre la densidad óptica de las bandas y la expresión de proteínas fue determinada utilizando una prueba GLM y la prueba Bonferroni como prueba post hoc (p0.05). La tasa de clivaje y de blastocistos para los tipos de CCO fueron de 88±4 y 89±8% y 36±7 y 33±8% respectivamente (TI n=220- TII n=161). El número de blastomeres fue 101 y 104 para TI y TII respectivamente. Las proteínas mayormente expresadas en las CC fueron alfa enolasa, beta-actina, estradiol 17-beta-dehidrogenasa 1, glutation S-transferasa, gliceraldehide 3-fosfatasa deshidrogenasa, proteína de choque térmico beta-1, histona H2B tipo 1-N, histona H4, mitocondria malate dehidrogenasa 2, proteina disulfito isomarasa A6, triosefospfato isomerasa, tubulin alfa-1C, vimentina. Las proteinas beta-actina y vimentina estuvieron mayormente expresadas en CC antes de maduración in vitro. En conclusión, no se encontró diferencias en la capacidad de desarrollo de CCO B. indicus con signos de expansión temprana indicando que ambos tipos podrían ser seleccionados para la PIVE. Las proteínas beta-actina y vimentina parecen ser importantes en el proceso de maduración de los CCO bovinos y posiblemente en la adquisición de la competencia

Evaluacion de la expresion de proteínas en las celulas del cumulo como marcadores de la capacidad de desarrollo del oocito bovino

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