Evaluación de diferentes métodos de extracción de ARN a partir del hongo nativo Xylaria sp.
La extracción de ARN de calidad constituye el primer paso para el análisis de la expresión génica. Sin embargo, su obtención no es sencilla debido a la susceptibilidad de esta molécula a la presencia de contaminantes como ARNasas, proteínas y polisacáridos. Adicionalmente, debido a la diversa compos...
- Autores:
-
Sandoval Pineda, Jhon Felipe
Ochoa Corona, Francisco
Torres Rojas, Esperanza
- Tipo de recurso:
- Article of journal
- Fecha de publicación:
- 2017
- Institución:
- Universidad Nacional de Colombia
- Repositorio:
- Universidad Nacional de Colombia
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
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- Acceso en línea:
- https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/66677
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- Palabra clave:
- 6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology
66 Ingeniería química y Tecnologías relacionadas/ Chemical engineering
biotecnología
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La extracción de ARN de calidad constituye el primer paso para el análisis de la expresión génica. Sin embargo, su obtención no es sencilla debido a la susceptibilidad de esta molécula a la presencia de contaminantes como ARNasas, proteínas y polisacáridos. Adicionalmente, debido a la diversa composición de la pared celular de los hongos se requiere optimizar los procesos de extracción de ARN para organismos específicos. Este estudio evalúo el uso de diferentes metodologías de homogeneización de tejido (nitrógeno líquido y liofilización) y extracción de ARN (Trizol, CTAB y RNeasy mini kit) a partir del hongo nativo ascomiceto Xylaria sp. Se determinó la pureza, concentración e integridad del ARN obtenido por medio de espectrofotometría y electroforesis. Adicionalmente, se diseñaron cebadores de referencia para el gen β-Tubulina a partir del alineamiento de secuencias de este gen obtenidas de diferentes ascomicetes. Estos cebadores fueron utilizados para evaluar si el ARN extraído es amplificable mediante RT-PCR. Se determinó que la homogeneización de tejido por medio de liofilización generó mayores rendimientos de extracción independientemente del protocolo de extracción utilizado; sin embargo, éstos alteraron la integridad del ARN. Se obtuvo un ARN con mayor pureza con el protocolo CTABy un mayor rendimiento con el RNeasy mini kit. Los resultados indican que el ARN extraído, independientemente de la metodología de homogeneización y extracción utilizada, es amplificable mediante RT-PCR. No obstante, se recomienda homogeneizar el tejido con nitrógeno líquido y extraer con RNeasy mini kit por la brevedad del protocolo de extracción y calidad obtenida. |
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Este estudio evalúo el uso de diferentes metodologías de homogeneización de tejido (nitrógeno líquido y liofilización) y extracción de ARN (Trizol, CTAB y RNeasy mini kit) a partir del hongo nativo ascomiceto Xylaria sp. Se determinó la pureza, concentración e integridad del ARN obtenido por medio de espectrofotometría y electroforesis. Adicionalmente, se diseñaron cebadores de referencia para el gen β-Tubulina a partir del alineamiento de secuencias de este gen obtenidas de diferentes ascomicetes. Estos cebadores fueron utilizados para evaluar si el ARN extraído es amplificable mediante RT-PCR. Se determinó que la homogeneización de tejido por medio de liofilización generó mayores rendimientos de extracción independientemente del protocolo de extracción utilizado; sin embargo, éstos alteraron la integridad del ARN. Se obtuvo un ARN con mayor pureza con el protocolo CTABy un mayor rendimiento con el RNeasy mini kit. Los resultados indican que el ARN extraído, independientemente de la metodología de homogeneización y extracción utilizada, es amplificable mediante RT-PCR. No obstante, se recomienda homogeneizar el tejido con nitrógeno líquido y extraer con RNeasy mini kit por la brevedad del protocolo de extracción y calidad obtenida.Obtaining high quality RNA is the first step for gene expression analysis. However, the low stability of this molecule and high presence of contaminants such as RNases, proteins and polysaccharides may trouble extractions. Fungi cell wall composition is highly diverse; therefore optimizing RNA extraction procedures is necessary when studying specific organisms. In this study, different methods of tissue homogenization (liquid nitrogen and lyophilization) and RNA extraction (Trizol, CTAB and RNeasy mini kit) were assessed with a native ascomycete, Xylaria sp. RNA purity, concentration and integrity were determined by spectrophotometry and electrophoresis. In addition, a set of housekeeping gene primers was designed targeting the β-tubulin gene. The primers were used to determine if the RNA extracted allowed RT-PCR amplification. It was demonstrated that homogenization of tissue by lyophilization allowed higher yields of RNA regardless of the extraction protocol used, however, the RNA integrity was affected. The higher RNA purity was obtained using CTAB and the higher yields using the RNeasy mini kit. The extracted RNA is amplifiable by RT-PCR regardless of the homogenization and extraction methodology used. However, it is recommended to homogenize the tissue with liquid nitrogen and to extract RNA with the RNeasy mini kit due the shortness and efficiency of these protocols.application/pdfspaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá - Instituto de Biotecnologíahttps://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/57114Universidad Nacional de Colombia Revistas electrónicas UN Revista Colombiana de BiotecnologíaRevista Colombiana de BiotecnologíaSandoval Pineda, Jhon Felipe and Ochoa Corona, Francisco and Torres Rojas, Esperanza (2017) Evaluación de diferentes métodos de extracción de ARN a partir del hongo nativo Xylaria sp. Revista Colombiana de Biotecnología, 19 (1). pp. 42-52. ISSN 1909-87586 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology66 Ingeniería química y Tecnologías relacionadas/ Chemical engineeringbiotecnologíainvestigaciónmicrobiologíaascomicetesβ-tubulinaliofilizaciónnitrógeno líquidoRT-PCRascomyceteβ-tubulinlyophilizationliquid nitrogenRT-PCREvaluación de diferentes métodos de extracción de ARN a partir del hongo nativo Xylaria sp.Artículo de revistainfo:eu-repo/semantics/articleinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_6501http://purl.org/coar/resource_type/c_2df8fbb1http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85Texthttp://purl.org/redcol/resource_type/ARTORIGINAL57114-336753-3-PB.pdfapplication/pdf913195https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/66677/1/57114-336753-3-PB.pdfb403fcded659d606bbc8791a1da77f65MD51THUMBNAIL57114-336753-3-PB.pdf.jpg57114-336753-3-PB.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg6896https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/66677/2/57114-336753-3-PB.pdf.jpga4450a7137e8d7968250cfb06ccf3564MD52unal/66677oai:repositorio.unal.edu.co:unal/666772023-05-26 23:03:04.315Repositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiarepositorio_nal@unal.edu.co |