Clonación, sobreexpresión y determinación de la especificidad iónica de Pma1, una posible Na+/K+ ATPasa de Mycobacterium smegmatis

La tuberculosis (TB) es uno de los retos más importantes para la salud pública en el mundo. Actualmente existe una prevalencia de 2 billones de personas infectadas con Mycobacterium tuberculosis, lo que representa el 30% de la población mundial; en este contexto la TB junto con el VIH/SIDA (Virus de Inmunodeficiencia Humana/Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) son las enfermedades que causan el mayor número de muertes ocasionadas por agentes infecciosos en el mundo, por lo que el descubrimiento de nuevos blancos terapéuticos es una prioridad en la investigación para el control de la TB. En la actualidad, las proteínas de membrana plasmática han ganado relevancia como blancos terapéuticos para el control de patógenos intracelulares, en especial, las proteínas encargadas del transporte iónico como los transportadores ABC, las ATPasas tipo P y los sistemas antiporter ion/H+. Específicamente, las ATPasas tipo P juegan un papel esencial en múltiples procesos biológicos de las células, entre ellos, la captura de nutrientes del medio extracelular, la desintoxicación con metales, la regulación del volumen celular, además son consideradas como factores de virulencia. De hecho, la homeóstasis iónica es relevante en la fisiología de la interacción hospedero-patógeno; ya que ambos han desarrollado mecanismos sofisticados para el transporte de iones hacia el interior o el exterior celular dependiendo de sus necesidades [1]. Se conoce que una vez fagocitada y durante la maduración del fagosoma, M. tuberculosis se enfrenta a variaciones considerables en la concentración de iones como Ca2+, K+ y Cl-, lo que también se ha relacionado con la acidificación del fagosoma [1]. Nuestro grupo de investigación se ha dedicado en los últimos años a indagar el potencial de las ATPasas tipo P o bombas de transporte catiónico (Ca2+, Na+, K+, Na+/K+), como dianas potenciales para el diseño de compuestos antimicobacterianos. Recientemente se ha considerado que Pma1, una posible ATPasa tipo P relacionada con el transporte de metales alcalinos/alcalinotérreos de Mycobacterium smegmatis, podría ser la contraparte del transportador CtpF de M. tuberculosis, este último de relevancia en los procesos de infección y condiciones de estrés del bacilo tuberculoso. Las características y el rol biológico de Pma1 son completamente desconocidas. En el presente trabajo, se realizó un estudio in silico del gen pma1 para determinar su posible especificidad iónica en M. smegmatis. Este análisis bioinformático determinó que esta posible ATPasa tipo P pertenece a un grupo de enzimas que transportan metales alcalinos/alcalinotérreos con mayor probabilidad de transportar Calcio y/ó Sodio/Potasio. Para confirmar esta predicción, el gen pma1 se clonó en el sistema pBAD-A-Myc-His y en el vector lanzadera pMV261 para determinar la influencia de la sobreexpresión del transportador en la viabilidad de células de E. coli y M. smegmatis respectivamente, bajo concentraciones tóxicas de diferentes metales alcalinos/alcalinotérreos. Se observó que Pma1 le proporciona a las células mayor tolerancia a concentraciones tóxicas de Na+, K+ y Na+/K+ en cultivo, siendo mayor el efecto para las micobacterias en comparación con E. coli. Por otra parte, mediante experimentos de PCR en tiempo real se determinaron cambios en el perfil transcripcional del gen pma1 en M. smegmatis cultivado en concentraciones sub-letales de metales alcalinos/alcalinotérreos (1100 mM Na+, 1100 mM K+, 1100 mM Na+/K+ y 400 mM Ca2+). Se observó que la estimulación iónica activa de forma decreciente la transcripción de pma1 en el siguiente orden: K+ Ca2+ Na+ Na+/K+. Finalmente, se realizaron ensayos de actividad ATPasa en vesículas de membrana plasmática de M. smegmatis y E. coli expresando la proteína Pma1 de M. smegmatis, donde se encontró que para M. smegmatis el transporte de iones en vesículas de membranas es activado de forma creciente de la siguiente manera: Na+ Ca2+ K+ Na+/K+, mientras que para E. coli se encontró así: Ca2+ Na+/K+ K+ Na+. Finalmente, se encontró que Pma1 presenta mayor afinidad por iones Ca2+ y mayor velocidad de transporte para iones Na+/K+. Los resultados obtenidos se podrían extrapolar al posible comportamiento que pueda tener su homólogo, CtpF, en el bacilo tuberculoso.

• Autores: Ayala Torres, Carlos Mario
• Fecha de publicación: 2014
• Institución: Universidad Nacional de Colombia
• Repositorio: Universidad Nacional de Colombia
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unal.edu.co:unal/53717
• Acceso en línea: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/53717; http://bdigital.unal.edu.co/48361/
• Palabra clave: 54 Química y ciencias afines / Chemistry; 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology; Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium smegmatis mc2155; ATPasas tipo P; Pma1; Metales alcalinos/alcalinotérreos; P-type ATPases; Alkali/alkaline earth metals
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