Estudio de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de leishmania braziliensis (LbNMNAT): Hacia la caracterización de un potencial blanco quimioterapéutico

ilustraciones, diagramas

Autores:: Pérez Mancipe, William Alexander

Tipo de recurso:

Fecha de publicación:: 2023

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

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Robledo, «A non-commercial approach for the generation of transgenic Leishmania tarentolae and its application in antileishmanial drug discovery», Parasitology, vol. 143, n.o 9, pp. 1133-1142, ago. 2016, doi: 10.1017/S0031182016000585. [5] O. P. de la Salud, «Leishmaniasis: Informe Epidemiológico de las Américas, No. 10 (Diciembre 2021)», Informe de Leishmaniasis, dic. 2021, Accedido: 15 de octubre de 2022. [En línea]. Disponible en: https://iris.paho.org/handle/10665.2/55344 [6] V. V. Andrade-Neto, H. L. de Matos-Guedes, D. C. de O. Gomes, M. M. do Canto- Cavalheiro, B. Rossi-Bergmann, y E. C. Torres-Santos, «The stepwise selection for ketoconazole resistance induces upregulation of C14-demethylase (CYP51) in Leishmania amazonensis», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 107, n.o 3, pp. 416-419, may 2012, doi: 10.1590/S0074-02762012000300018. [7] S. L. Croft, S. Sundar, y A. H. Fairlamb, «Drug resistance in leishmaniasis», Clin Microbiol Rev, vol. 19, n.o 1, pp. 111-126, ene. 2006, doi: 10.1128/CMR.19.1.111- 126.2006. [8] J. Chakravarty y S. Sundar, «Drug Resistance in Leishmaniasis», J Glob Infect Dis, vol. 2, n.o 2, p. 167, 2010, doi: 10.4103/0974-777X.62887. [9] L. E. Contreras Rodríguez, «Obtención y caracterización bioquímica y funcional de la enzima recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT)», Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, 2016. [10] C. G. Granados Ramírez, L. E. Contreras Rodríguez, O. L. J. Joya, y M. H. Ramírez Hernández, «Efecto inhibitorio del imidazol sobre la actividad de la NMNAT de Leishmania braziliensis», en Libro de Memorias Del Segundo Congreso Colombiano de Bioquímica y Biología Molecular. Medellín Colombia. ISBN 978-958-59491-1-9., 2016, p. 253. [11] R. L. Charlton, B. Rossi-Bergmann, P. W. Denny, y P. G. Steel, «Repurposing as a strategy for the discovery of new anti-leishmanials: the-state-of-the-art», Parasitology, vol. 145, n.o 2, p. 219, feb. 2018, doi: 10.1017/S0031182017000993. [12] H. V. Tolomeu y C. A. M. Fraga, «Imidazole: Synthesis, Functionalization and Physicochemical Properties of a Privileged Structure in Medicinal Chemistry», Molecules, vol. 28, n.o 2, ene. 2023, doi: 10.3390/MOLECULES28020838. [13] L. J. Ortiz Joya, «Caracterización de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT) mediante análisis estructural y de interacción proteína-proteína», Universidad Nacional de Colombia, 2017. [14] W. H. Organization, «Control of the leishmaniases. Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases, Geneva, 22–26 March 2010», World Health Organ Tech Rep Ser, n.o 949, pp. xii-xiii, 1-186, back cover, 2010. [15] P. A. Bates, «Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies», International Journal for Parasitology, vol. 37, n.o 10. Pergamon, pp. 1097-1106, 1 de agosto de 2007. doi: 10.1016/j.ijpara.2007.04.003. [16] M. Akhoundi et al., «A Historical Overview of the Classification, Evolution, and Dispersion of Leishmania Parasites and Sandflies», PLoS Neglected Tropical Diseases, vol. 10, n.o 3. Public Library of Science, 3 de marzo de 2016. doi: 10.1371/journal.pntd.0004349. [17] B. Zulfiqar, T. B. Shelper, y V. M. Avery, «Leishmaniasis drug discovery: recent progress and challenges in assay development», Drug Discovery Today, vol. 22, n.o 10. Elsevier Ltd, pp. 1516-1531, 1 de octubre de 2017. doi: 10.1016/j.drudis.2017.06.004. [18] D. Pace, «Leishmaniasis», Journal of Infection, vol. 69, n.o S1, pp. S10-S18, nov. 2014, doi: 10.1016/j.jinf.2014.07.016. [19] Pan American Health Organization, Manual of procedures for surveillance and control of leishmaniasis in the Americas. PAHO/WHO, 2019. [20] «Leishmaniasis». https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/leishmaniasis (accedido 15 de octubre de 2022). [21] PubChem, «Nadide \| C21H27N7O14P2 - PubChem». https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5892 (accedido 8 de mayo de 2020). [22] M. Arenas-Jal, J. M. Suñé-Negre, y E. García-Montoya, «Therapeutic potential of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)», Eur J Pharmacol, vol. 879, p. 173158, jul. 2020, doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173158. [23] M. Pehar, B. A. Harlan, K. M. Killoy, y M. R. Vargas, «Nicotinamide Adenine Dinucleotide Metabolism and Neurodegeneration», Antioxidants and Redox Signaling, vol. 28, n.o 18. Mary Ann Liebert Inc., pp. 1652-1668, 20 de junio de 2018. doi: 10.1089/ars.2017.7145. [24] C. Cantó, K. J. Menzies, y J. Auwerx, «NAD+ Metabolism and the Control of Energy Homeostasis: A Balancing Act between Mitochondria and the Nucleus», Cell Metabolism, vol. 22, n.o 1. Cell Press, pp. 31-53, 7 de julio de 2015. doi: 10.1016/j.cmet.2015.05.023. [25] I. Mesquita et al., «Exploring NAD+ metabolism in host-pathogen interactions», Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 73, n.o 6. Birkhauser Verlag AG, pp. 1225- 1236, 1 de marzo de 2016. doi: 10.1007/s00018-015-2119-4. [26] A. S. Marletta, A. Massarotti, G. Orsomando, G. Magni, M. Rizzi, y S. Garavaglia, «Crystal structure of human nicotinic acid phosphoribosyltransferase», FEBS Open Bio, vol. 5, pp. 419-428, ene. 2015, doi: 10.1016/j.fob.2015.05.002. [27] R. Capela, R. Moreira, y F. Lopes, «An overview of drug resistance in protozoal diseases», International Journal of Molecular Sciences, vol. 20, n.o 22. MDPI AG, 2 de noviembre de 2019. doi: 10.3390/ijms20225748. [28] S. Emami, P. Tavangar, y M. Keighobadi, «An overview of azoles targeting sterol 14α-demethylase for antileishmanial therapy», European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 135. Elsevier Masson SAS, pp. 241-259, 2017. doi: 10.1016/j.ejmech.2017.04.044. [29] P. R. Murumkar y R. B. Ghuge, «Vicinal Diaryl Oxadiazoles, Oxazoles, and Isoxazoles», en Vicinal Diaryl Substituted Heterocycles, Elsevier, 2018, pp. 277-303. doi: 10.1016/B978-0-08-102237-5.00009-2. [30] N. Martínez-Matías y J. R. Rodríguez-Medina, «• REVIEW ARTICLE • Fundamental Concepts of Azole Compounds and Triazole Antifungals: A Beginner’s Review», 2018. [31] S. S. Braga, «Multi-target drugs active against leishmaniasis: A paradigm of drug repurposing», European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 183. Elsevier Masson SAS, 1 de diciembre de 2019. doi: 10.1016/j.ejmech.2019.111660. [32] J. S. de Araújo et al., «Imidazole derivatives as promising agents for the treatment of Chagas disease», Antimicrob Agents Chemother, vol. 63, n.o 4, abr. 2019, doi: 10.1128/AAC.02156-18. [33] C. M. Cuesta y J. A. Hernández, «Desarrollo de nuevos fármacos en parasitología», en Parasitología médica, 5e, M. A. B. Flores, Ed., New York, NY: McGraw-Hill Education, 2019. [34] R. G. Zhai, M. Rizzi, y S. Garavaglia, «Nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase, new insights into an ancient enzyme», Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 66, n.o 17. Cell Mol Life Sci, pp. 2805-2818, septiembre de 2009. doi: 10.1007/s00018-009-0047-x. [35] C. Cui, J. Qi, Q. Deng, R. Chen, D. Zhai, y J. Yu, «Nicotinamide Mononucleotide Adenylyl Transferase 2: A Promising Diagnostic and Therapeutic Target for Colorectal Cancer», Biomed Res Int, vol. 2016, 2016, doi: 10.1155/2016/1804137. [36] M. Ginouves, B. Carme, P. Couppie, y G. Prevot, «Comparison of tetrazolium salt assays for evaluation of drug activity against leishmania spp.», J Clin Microbiol, vol. 52, n.o 6, pp. 2131-2138, 2014, doi: 10.1128/JCM.00201-14. [37] M. Ginouves, B. Carme, P. Couppie, y G. Prevot, «Comparison of tetrazolium salt assays for evaluation of drug activity against leishmania spp.», J Clin Microbiol, vol. 52, n.o 6, pp. 2131-2138, 2014, doi: 10.1128/JCM.00201-14. [38] S. Gupta y Nishi, «Visceral leishmaniasis: Experimental models for drug discovery», Indian Journal of Medical Research, vol. 133, n.o 1. Wolters Kluwer -- Medknow Publications, pp. 27-39, enero de 2011. [39] J. R. Haanstra, E. B. González-Marcano, M. Gualdrón-López, y P. A. M. Michels, «Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites», Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, vol. 1863, n.o 5. Elsevier B.V., pp. 1038-1048, 1 de mayo de 2016. doi: 10.1016/j.bbamcr.2015.09.015. [40] A. A. Religa y A. P. Waters, «Sirtuins of parasitic protozoa: In search of function(s)», Molecular and Biochemical Parasitology, vol. 185, n.o 2. Elsevier, pp. 71-88, octubre de 2012. doi: 10.1016/j.molbiopara.2012.08.003. [41] S. K. Ardestani et al., «Cell death features induced in Leishmania major by 1,3,4- thiadiazole derivatives», Exp Parasitol, vol. 132, n.o 2, pp. 116-122, oct. 2012, doi: 10.1016/j.exppara.2012.06.002. [42] L. E. Contreras Rodríguez, R. Neme, y M. H. Ramírez, «Aproximación al Metabolismo del Dinucleótido de Nicotinamida y Adenina (NAD+) en Leishmania», Revista de la Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas, vol. 22, pp. 97-112, 2010. [43] L. E. Contreras Rodríguez, M. Ziegler, y M. H. Ramírez Hernández, «Kinetic and oligomeric study of Leishmania braziliensis nicotinate/nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase», Heliyon, vol. 6, n.o 4, p. e03733, abr. 2020, doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e03733. [44] L. Ortiz-Joya, L. E. Contreras-Rodríguez, y M. H. Ramírez-Hernández, «Proteinprotein interactions of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase of leishmania braziliensis», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 114, n.o 2, feb. 2019, doi: 10.1590/0074-02760180506. [45] S. P. Georgiadou, K. P. Makaritsis, y G. N. Dalekos, «Leishmaniasis revisited: Current aspects on epidemiology, diagnosis and treatment», J Transl Int Med, vol. 3, n.o 2, pp. 43-50, dic. 2016, doi: 10.1515/jtim-2015-0002. [46] E. L. Galvão, A. Rabello, y G. F. Cota, «Efficacy of azole therapy for tegumentary leishmaniasis: A systematic review and meta-analysis», PLoS One, vol. 12, n.o 10, oct. 2017, doi: 10.1371/journal.pone.0186117. [47] V. V. Andrade-Neto et al., «Leishmaniasis treatment: Update of possibilities for drug repurposing», Frontiers in Bioscience - Landmark, vol. 23, n.o 5, pp. 967-996, ene. 2018, doi: 10.2741/4629. [48] R. L. Charlton, B. Rossi-Bergmann, P. W. Denny, y P. G. Steel, «Repurposing as a strategy for the discovery of new anti-leishmanials: The-state-of-the-art», Parasitology, vol. 145, n.o 2. Cambridge University Press, pp. 219-236, 1 de febrero de 2018. doi: 10.1017/S0031182017000993. [49] J. A. R. Vargas, A. G. Lopez, M. C. Piñol, y M. Froeyen, «Molecular docking study on the interaction between 2-substituted-4,5-difuryl Imidazoles with different Protein Target for antileishmanial activity», J Appl Pharm Sci, vol. 8, n.o 3, pp. 014-022, mar. 2018, doi: 10.7324/JAPS.2018.8303. [50] A. Kumar, S. C. Pandey, y M. Samant, «Slow pace of antileishmanial drug development», Parasitol Open, vol. 4, 2018, doi: 10.1017/pao.2018.1. [51] A. Niño y M. Camacho, «Leishmania (Viannia) braziliensis growth in vitro culture relies more on folic acid availability than Leihsmania (Leishmania) amazonensis», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 100, n.o 3, pp. 309-310, 2005, doi: 10.1590/S0074- 02762005000300017. [52] M. E. Forero, M. Marín, A. Corrales, I. Llano, H. Moreno, y M. Camacho, «Leishmania amazonensis infection induces changes in the electrophysiological properties of macrophage-like cells», Journal of Membrane Biology, vol. 170, n.o 2, pp. 173-180, 1999, doi: 10.1007/s002329900547. [53] B. J. Celeste y M. C. Guimarães, «Growth curves of Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes and surface antigen expression before and after adaptation to Schneider’s Drosophila medium as assessed by anti-Leishmania human sera.», Rev Inst Med Trop Sao Paulo, vol. 30, n.o 2, pp. 63-67, mar. 1988, doi: 10.1590/S0036-46651988000200001. [54] T. Mosmann, «Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays», 1983. [55] S. Rahimi et al., «The leishmanicidal effect of Lucilia sericata larval saliva and hemolymph on in vitro Leishmania tropica», Parasit Vectors, vol. 14, n.o 1, pp. 1-12, dic. 2021, doi: 10.1186/S13071-020-04543-Y/TABLES/5. [56] S. Muelas-Serrano, J. J. Nogal-Ruiz, y A. Gómez-Barrio, «Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes», Parasitol Res, vol. 86, n.o 12, pp. 999-1002, 2000, doi: 10.1007/PL00008532. [57] J. Sambrook y Russell D.W, Molecular Cloning: A Labortaroy Manual. 2001. doi: 10.1128/AEM.68.3.1232. [58] A. Dutta, S. Bandyopadhyay, C. Mandal, y M. Chatterjee, «Development of a modified MTT assay for screening antimonial resistant field isolates of Indian visceral leishmaniasis», Parasitol Int, vol. 54, n.o 2, pp. 119-122, 2005, doi: 10.1016/j.parint.2005.01.001. [59] B. S. Borges, G. de P. Bueno, F. Tomiotto-Pellissier, F. B. Figueiredo, y L. C. Soares Medeiros, «In vitro anti-Leishmania activity of triclabendazole and its synergic effect with amphotericin B», Front Cell Infect Microbiol, vol. 12, ene. 2023, doi: 10.3389/FCIMB.2022.1044665/FULL. [60] V. D. Atayde, E. Ullu, y N. G. Kolev, «A single-cloning-step procedure for the generation of RNAi plasmids producing long stem-loop RNA», Mol Biochem Parasitol, vol. 184, n.o 1, p. 55, jul. 2012, doi: 10.1016/J.MOLBIOPARA.2012.04.003. [61] O. Trott y A. J. Olson, «AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading», J Comput Chem, vol. 31, n.o 2, p. 455, ene. 2010, doi: 10.1002/JCC.21334. [62] M. F. Sanner, «Python: a programming language for software integration and development - PubMed», Journal of molecular graphics & modelling, 1999. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10660911/ (accedido 24 de enero de 2022). [63] E. F. Pettersen et al., «UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis», J Comput Chem, vol. 25, n.o 13, pp. 1605-1612, oct. 2004, doi: 10.1002/JCC.20084. [64] M. Bradford, «A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding», Anal Biochem, vol. 72, n.o 1-2, pp. 248-254, may 1976, doi: 10.1006/abio.1976.9999. [65] M. Emanuelli, N. Raffaelli, A. Amici, M. Fanelli, S. Ruggieri, y G. Magni, «Threeminute high-performance liquid chromatographic assay for NMN adenylyltransferase using a 20-mm-long reversed-phase column», J Chromatogr B Biomed Sci Appl, vol. 676, n.o 1, pp. 13-18, feb. 1996, doi: 10.1016/0378-4347(95)00408-4. [66] R. Levy, E. Gregory, W. Borcherds, y G. Daughdrill, «p53 phosphomimetics preserve transient secondary structure but reduce binding to Mdm2 and MdmX», Biomolecules, vol. 9, n.o 3, p. 83, mar. 2019, doi: 10.3390/biom9030083. [67] N. Blom, S. Gammeltoft, y S. Brunak, «Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites», J Mol Biol, vol. 294, n.o 5, pp. 1351-1362, dic. 1999, doi: 10.1006/jmbi.1999.3310. [68] A. Palmeri et al., «PhosTryp: a phosphorylation site predictor specific for parasitic protozoa of the family trypanosomatidae», BMC Genomics, vol. 12, p. 614, dic. 2011, doi: 10.1186/1471-2164-12-614. [69] M. Baek et al., «Accurate prediction of protein structures and interactions using a 3- track neural network», Science, vol. 373, n.o 6557, p. 871, ago. 2021, doi: 10.1126/SCIENCE.ABJ8754. [70] M. Mirdita, K. Schütze, Y. Moriwaki, L. Heo, S. Ovchinnikov, y M. Steinegger, «ColabFold: making protein folding accessible to all», Nature Methods 2022 19:6, vol. 19, n.o 6, pp. 679-682, may 2022, doi: 10.1038/s41592-022-01488-1. [71] R. J. Anderson, Z. Weng, R. K. Campbell, y X. Jiang, «Main-chain conformational tendencies of amino acids», Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, vol. 60, n.o 4, pp. 679-689, sep. 2005, doi: 10.1002/PROT.20530. [72] D. M. Sánchez-Lancheros, L. F. Ospina-Giraldo, y M. H. Ospina-Giraldo, «Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase of Trypanosoma cruzi (TcNMNAT): a cytosol protein target for serine kinases», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 111, n.o 11, pp. 670-675, nov. 2016, doi: 10.1590/0074-02760160103. [73] L. E. Contreras Rodríguez, «Obtención y caracterización bioquímica y funcional de la enzima recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT)», 2016. [74] J. Engebrecht, R. Brent, y M. A. Kaderbhai, Minipreps of Plasmid DNA, vol. 15, n.o 1. Wiley, 2001. doi: 10.1002/0471142727.mb0106s15. [75] L. E. Contreras Rodríguez, «Obtención y caracterización bioquímica y funcional de la enzima recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT)», 2016. [76] M. Ghasemi, T. Turnbull, S. Sebastian, y I. Kempson, «The mtt assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis», Int J Mol Sci, vol. 22, n.o 23, dic. 2021, doi: 10.3390/IJMS222312827/S1. [77] Software GraphPad Prism, «Equation: Exponential growth». https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/curvefitting/ reg_exponential_growth.htm (accedido 12 de febrero de 2023). [78] A. S. Nagle et al., «Recent developments in drug discovery for leishmaniasis and human african trypanosomiasis», Chem Rev, vol. 114, n.o 22, pp. 11305-11347, nov. 2014, doi: 10.1021/CR500365F/ASSET/IMAGES/LARGE/CR-2014- 00365F_0012.JPEG. [79] A. Shokri et al., «Promising antileishmanial activity of novel imidazole antifungal drug luliconazole against Leishmania major: In vitro and in silico studies», J Glob Antimicrob Resist, vol. 14, pp. 260-265, sep. 2018, doi: 10.1016/J.JGAR.2018.05.007. [80] D. C. de O. S. Nunes et al., «Mitochondrial dysfunction on Leishmania (Leishmania) amazonensis induced by ketoconazole: insights into drug mode of action», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 117, 2022, doi: 10.1590/0074-02760210157. [81] M. L. Kennedy et al., «Leishmanicidal and reversal multidrug resistance constituents from Aeonium lindleyi», Planta Med, vol. 77, n.o 1, pp. 77-80, 2011, doi: 10.1055/S- 0030-1250144. [82] R. E. Saenz, H. Paz, y J. D. Berman, «Efficacy of ketoconazole against Leishmania braziliensis panamensis cutaneous leishmaniasis», Am J Med, vol. 89, n.o 2, pp. 147- 155, 1990, doi: 10.1016/0002-9343(90)90292-L. [83] L. K. Rushworth et al., «Repurposing screen identifies mebendazole as a clinical candidate to synergise with docetaxel for prostate cancer treatment», Br J Cancer, vol. 122, n.o 4, p. 517, feb. 2020, doi: 10.1038/S41416-019-0681-5. [84] «JPMA - Journal Of Pakistan Medical Association». https://jpma.org.pk/articledetails/ 5571?article_id=5571 (accedido 30 de enero de 2023). [85] C. Alauzet, A. Lozniewski, y H. Marchandin, «Metronidazole resistance and nim genes in anaerobes: A review», Anaerobe, vol. 55. Academic Press, pp. 40-53, 1 de febrero de 2019. doi: 10.1016/j.anaerobe.2018.10.004. [86] A. Naif, H. Hasan, y K. Kadhim, «Metronidazole versus Pentostam for treatment of cutaneous leishmaniasis», Gazzetta Medica Italiana Archivio per le Scienze Mediche, vol. 177, n.o 11, pp. 611-616, nov. 2018, doi: 10.23736/S0393- 3660.17.03627-0. [87] J. S. Keithly y S. G. Langreth, «Inefficacy of Metronidazole in Experimental Infections of Leishmania Donovani, L. Mexicana, and Trypanosoma Brucei Brucei», Am J Trop Med Hyg, vol. 32, n.o 3, pp. 485-496, may 1983, doi: 10.4269/AJTMH.1983.32.485. [88] D. Leitsch, «A review on metronidazole: an old warhorse in antimicrobial chemotherapy», Parasitology, vol. 146, n.o 9, pp. 1167-1178, ago. 2019, doi: 10.1017/S0031182017002025. [89] M. P. Deutscher, «Chapter 10 Maintaining Protein Stability», Methods Enzymol, vol. 463, n.o C, pp. 121-127, ene. 2009, doi: 10.1016/S0076-6879(09)63010-X [90] R. R. Burgess, «Chapter 17 Refolding Solubilized Inclusion Body Proteins», Methods Enzymol, vol. 463, n.o C, pp. 259-282, ene. 2009, doi: 10.1016/S0076- 6879(09)63017-2. [91] W. W. Cleland, «DITHIOTHREITOL, A NEW PROTECTIVE REAGENT FOR SH GROUPS», Biochemistry, vol. 3, n.o 4, pp. 480-482, abr. 1964, doi: 10.1021/BI00892A002. [92] V. M. Bolanos-Garcia y O. R. Davies, «Structural analysis and classification of native proteins from E. coli commonly co-purified by immobilised metal affinity chromatography», Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1760, n.o 9, pp. 1304-1313, sep. 2006, doi: 10.1016/J.BBAGEN.2006.03.027. [93] R. Petrelli, K. Felczak, y L. Cappellacci, «NMN/NaMN adenylyltransferase (NMNAT) and NAD kinase (NADK) inhibitors: chemistry and potential therapeutic applications», Curr Med Chem, vol. 18, n.o 13, pp. 1973-1992, may 2011, doi: 10.2174/092986711795590048. [94] G. Indrayanto, G. S. Putra, y F. Suhud, «Validation of in-vitro bioassay methods: Application in herbal drug research», Profiles Drug Subst Excip Relat Methodol, vol. 46, pp. 273-307, ene. 2021, doi: 10.1016/BS.PODRM.2020.07.005. [95] G. W. Caldwell, Z. Yan, W. Lang, y J. A. Masucci, «The IC(50) concept revisited», Curr Top Med Chem, vol. 12, n.o 11, pp. 1282-1290, may 2012, doi: 10.2174/156802612800672844. [96] C. G. Granados-Ramírez, L. E. Contreras-Rodríguez, y M. H. Ramírez-Hernández, «Optimización del ensayo de inhibición de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenililtransferasa de Leishmania braziliensis», Rev Acad Colomb Cienc Exactas Fis Nat, vol. 45, n.o 176, pp. 721-730, jul. 2021, doi: 10.18257/RACCEFYN.1272. [97] L. F. Lye et al., «Retention and Loss of RNA Interference Pathways in Trypanosomatid Protozoans», PLoS Pathog, vol. 6, n.o 10, p. e1001161, oct. 2010, doi: 10.1371/JOURNAL.PPAT.1001161. [98] K. K. Ojo et al., «Glycogen Synthase Kinase 3 Is a Potential Drug Target for African Trypanosomiasis Therapy», Antimicrob Agents Chemother, vol. 52, n.o 10, p. 3710, oct. 2008, doi: 10.1128/AAC.00364-08. [99] K. K. Ojo et al., «Structure determination of glycogen synthase kinase-3 from Leishmania major and comparative inhibitor structure–activity relationships with Trypanosoma brucei GSK-3», Mol Biochem Parasitol, vol. 176, n.o 2, pp. 98-108, abr. 2011, doi: 10.1016/J.MOLBIOPARA.2010.12.009. [100] A. Efstathiou y D. Smirlis, «Leishmania Protein Kinases: Important Regulators of the Parasite Life Cycle and Molecular Targets for Treating Leishmaniasis», Microorganisms, vol. 9, n.o 4, abr. 2021, doi: 10.3390/MICROORGANISMS9040691. [101] E. Xingi et al., «6-Br-5methylindirubin-3′oxime (5-Me-6-BIO) targeting the leishmanial glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) short form affects cell-cycle progression and induces apoptosis-like death: Exploitation of GSK-3 for treating leishmaniasis», Int J Parasitol, vol. 39, n.o 12, pp. 1289-1303, oct. 2009, doi: 10.1016/J.IJPARA.2009.04.005. [102] J. Guo y H. X. Zhou, «Protein Allostery and Conformational Dynamics», Chem Rev, vol. 116, n.o 11, p. 6503, jun. 2016, doi: 10.1021/ACS.CHEMREV.5B00590. [103] L. Uhrik et al., «Allosteric changes in HDM2 by the ATM phosphomimetic S395D mutation: implications on HDM2 function», Biochemical Journal, vol. 476, n.o 21, p. 3401, nov. 2019, doi: 10.1042/BCJ20190687. [104] Y. O. Ali, R. McCormack, A. Darrand, y R. G. Zhai, «Nicotinamide Mononucleotide Adenylyltransferase Is a Stress Response Protein Regulated by the Heat Shock Factor/Hypoxia-inducible Factor 1α Pathway», J Biol Chem, vol. 286, n.o 21, p. 19089, may 2011, doi: 10.1074/JBC.M111.219295. [105] E. Schastnaya et al., «Extensive regulation of enzyme activity by phosphorylation in Escherichia coli», Nature Communications 2021 12:1, vol. 12, n.o 1, pp. 1-11, sep. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-25988-4. [106] B. Macek et al., «Phosphoproteome analysis of E. coli reveals evolutionary conservation of bacterial Ser/Thr/Tyr phosphorylation», Mol Cell Proteomics, vol. 7, n.o 2, pp. 299-307, feb. 2008, doi: 10.1074/MCP.M700311-MCP200. [107] E. Beurel, S. F. Grieco, y R. S. Jope, «Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): regulation, actions, and diseases», Pharmacol Ther, vol. 0, p. 114, 2015, doi: 10.1016/J.PHARMTHERA.2014.11.016. [108] M. Julien, C. Bouguechtouli, A. Alik, R. Ghouil, S. Zinn-Justin, y F. X. Theillet, «Multiple Site-Specific Phosphorylation of IDPs Monitored by NMR», Methods in Molecular Biology, vol. 2141, n.o 26, pp. 793--817, 2020, doi: 10.1007/978-1-0716- 0524-0_41. [109] H. Nishi, A. Shaytan, y A. R. Panchenko, «Physicochemical mechanisms of protein regulation by phosphorylation», Front Genet, vol. 5, n.o AUG, p. 270, ago. 2014, doi: 10.3389/FGENE.2014.00270/BIBTEX. [110] B. M. Chacko, B. Qin, J. J. Correia, S. S. Lam, M. P. de Caestecker, y K. Lin, «The L3 loop and C-terminal phosphorylation jointly define Smad protein trimerization», Nat Struct Biol, vol. 8, n.o 3, pp. 248-253, 2001, doi: 10.1038/84995. [111] J. M. Brazill, C. Li, Y. Zhu, y R. G. Zhai, «NMNAT: It’s an NAD+ Synthase… It’s a Chaperone… It’s a Neuroprotector», Curr Opin Genet Dev, vol. 44, p. 156, jun. 2017, doi: 10.1016/J.GDE.2017.03.014.
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spelling	Atribución-NoComercial 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Ramírez Hernández, María Helena3cd22161e24a39009214e3120ed6f39bPérez Mancipe, William Alexander0aa7be8dfaf34bb93133182580d3d43dLaboratorio de Investigaciones Básicas en Bioquímica – LIBBIQPérez-Mancipe W2023-07-27T14:25:07Z2023-07-27T14:25:07Z2023https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/84301Universidad Nacional de ColombiaRepositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiahttps://repositorio.unal.edu.co/ilustraciones, diagramasLa leishmaniasis es un problema de salud pública en los países donde se presenta de manera endémica [1]. La búsqueda de fármacos de baja toxicidad para el paciente y la identificación de nuevos blancos terapéuticos, han sido unas de las estrategias de lucha en contra de esta parasitemia. El Laboratorio de investigaciones básicas en bioquímica (LIBBIQ), ha concentrado su interés en el metabolismo del Dinucleótido de Nicotinamida y Adenina (NAD+) en Leishmania braziliensis, específicamente en la enzima central de su metabolismo, la Nicotinamida Mononucleotido Adenilil Transferasa (LbNMNAT). Resaltando sus características como posible blanco terapéutico por su papel fundamental en el metabolismo del parásito y su supervivencia [2]. Por ello se consideró de relevancia continuar con la caracterización de la LbNMNAT, una enzima central en el metabolismo del NAD+. En este trabajo se emplearon diversas estrategias metodológicas bioinformáticas y experimentales. Inicialmente se emplearon promastigotes para evaluar el efecto que tendrían algunos derivados imidazolicos sobre su viabilidad, para ello se empleo el método colorimétrico (MTT), hallando efecto con el ketoconazol con un IC50 de 27,9 μM; también se planteó una propuesta metodología utilizando la Proteína verde fluorescente para evaluar estos efectos [3], [4]. Se generaron proteínas recombinantes para analizar el efecto de los derivados imidazolicos sobre la actividad catalítica de la LbNMNAT. Se encontró inhibición con los derivados benzimidazólicos (fenbendazol y el mebendazol) en concentraciones micromolares, lo cual podría estar relacionado con las bajas energías de unión que fueron predichas en el acoplamiento molecular para estos compuestos. Finalmente, en busca de caracterizar estructuralmente a la LbNMNAT, se analizó el efecto de la fosforilación como mecanismo de regulación enzimática; empleando análisis bioinformáticos, se predijo el residuo serina 210 como el sitio más probable de ser fosforilado. V Para el estudio de la fosforilación de la LbNMNAT se emplearon herramientas de biología molecular; mediante mutagénesis dirigida se generó el mutante fosfomimético LbNMNAT S210D, el cual corresponde a una región especifica de la proteina del parásito. El análisis del efecto de la mutación fosfomimética sobre la actividad adenilil transferasa de la enzima, evaluado por ensayos enzimáticos directos (RP-HPLC), no mostro diferencias respecto a la proteina nativa. Sin embargo, es necesario explorar el efecto que podría tener esta modificación sobre otras posibles funciones de la Lb-NMNAT, que se encuentran en investigación tales como la actividad chaperona. (Texto tomado de la fuente)Leishmaniasis is a public health problem in countries where it is endemic [1]. The search for drugs with low toxicity for the patient and the identification of new therapeutic targets have been some of the strategies to combat this parasitemia. The Basic Research Laboratory in Biochemistry (LIBBIQ) has focused its interest on the metabolism of Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) in Leishmania braziliensis, specifically on the central enzyme of its metabolism, Nicotinamide Mononucleotide Adenylyl Transferase (LbNMNAT). Highlighting its characteristics as a possible therapeutic target due to its fundamental role in the metabolism of the parasite and its survival [2]. For this reason, it was considered relevant to continue with the characterization of LbNMNAT, a central enzyme in the metabolism of NAD+. Various bioinformatics and experimental methodological strategies were used in this work. Initially, promastigotes were used to evaluate the effect that some imidazole derivatives would have on viability. For this, the colorimetric method (MTT) was used, finding an effect with ketoconazole with an IC50 of 27.9 μM; A proposed methodology using Green Fluorescent Protein to assess these effects was also put forward [3], [4]. Recombinant proteins were generated to analyze the effect of imidazolic derivatives on the catalytic activity of LbNMNAT. Inhibition was found with benzimidazole derivatives (fenbendazole and mebendazole) at micromolar concentrations, which could be related to the low binding energies that were predicted in docking molecular for these compounds. Finally, seeking to structurally characterize LbNMNAT, the effect of phosphorylation as an enzymatic regulation mechanism was analyzed; using bioinformatic analyses, the serine 210 residue was predicted as the most likely site to be phosphorylated. Molecular biology tools were used to study the phosphorylation of LbNMNAT; through site-directed mutagenesis, the phosphomimetic mutant LbNMNAT S210D was generated, which corresponds to a specific region of the parasite protein. The analysis of the effect of the phosphomimetic mutation on the adenylyl transferase activity of the enzyme, evaluated VII by direct enzymatic assays (RP-HPLC), did not show differences with respect to the native protein. However, it is necessary to explore the effect that this modification could have on other possible functions of Lb-NMNAT, which are under investigation, such as chaperone activity.División de Investigación Sede Bogotá (DIB), Universidad Nacional de ColombiaMaestríaMagíster en Ciencias Bioquímica7. Metodología Se usó la siguiente estrategia metodología (Fig. 8-1) para desarrollar cada uno de los objetivos propuestos como se describe a continuación: 7.1 Metodología para explorar el potencial citotóxico de algunos inhibidores imidazolicos sobre cultivos de promastigotes de L. braziliensis evaluando la viabilidad celular (por métodos colorimétrico o fluorescentes). 7.1.1 Cultivo de promastigotes de L. braziliensis. Promastigotes de L. braziliensis (M2904 MHOM/BR/75M2904), se mantuvieron en medio Schneider pH 7.4 (Sigma) suplementado con suero fetal bovino inactivado al 10% (V/V) a una temperatura de 26°C, en frascos de 25cm (T25), sin agitación. Cada vez que se alcanzó la fase estacionaria de crecimiento realizo un repique (pase) a medio fresco [51], [52] 7.1.2 Optimización del método colorimétrico MTT para la evaluación de la viabilidad celular. Para llevar a cabo esta optimización primero se realizaron curvas de crecimiento de los parásitos para conocer su comportamiento en las condiciones de cultivo utilizadas. Posteriormente se estandarizo el método colorimétrico de MTT. Curvas de crecimiento de Promastigotes de L. braziliensis. Las curvas de crecimiento se realizaron cultivando promastigotes de L. braziliensis en medio Schneider, suplementado con SBF (Suero Bovino Fetal) inactivado al 10%, a una temperatura de 26°C, en frascos de 25cm. Se partió de una concentración inicial de 500.000 parásitos/ml a un volumen final de 8ml. El número de parásitos se monitoreo por conteo con hemocitómetro, hasta el día 7 de cultivo [53]. Selección del mejor disolvente de los cristales de formazan y la concentración optima del reactivo MTT. En placas de 96 pozos se realizaron diluciones de parásitos de 1 x107 a 19.531 parásitos/ml, en un volumen final de 100 μl, posteriormente se adicionaron 10 μl de una solución de MTT 5mg/ml, se dejó incubar 4 horas a 37 °C. Para disolver los cristales de formazan se adicionaron 100 μl de cada uno de los solventes evaluados, el isopropanol 0.04N HCL [54], DMSO [55] y SDS 0,01N HCL [56]. Se homogenizo y realizo lectura de la placa a 540nm. Como blanco se utilizaron 100μl de parásitos a una concentración de 1 x107 parásitos/ml más 100 μl del respectivo disolvente, se homogenizo y adicionaron 10 μl de la solución de MTT 5mg/ml. El valor de absorbancia de las muestras les fue restado el valor del blanco. Se realizaron los cálculos de la correlación lineal entre la concentración de parásitos y las absorbancias obtenidas. Una vez se determinó el mejor disolvente, se realizó el mismo diseño experimental previamente explicado, pero con distintas concentraciones finales de MTT en la placa (0,9, 0,68, 0,45 y 0,22 mg/ml); y así, evaluar cuál es la concentración optima, bajo los criterios de valores más altos de absorbancia y correlación lineal entre esta y el número de parásitos. 7.1.3 Evaluación de la acción de los imidazoles sobre promastigotes de L. braziliensis. Para estas evaluaciones se usó la información que se logró con la optimización del método de MTT del apartado anterior. Se preparó una suspensión promastigotes en fase de crecimiento exponencial, con la ayuda de un hemocitómetro [57] . Se realizaron diluciones seriadas de los medicamentos a evaluar y dispensaron en placas de 96 pozos, luego se adicionaron los parásitos en cada uno de los pozos a una concentración de 1x105 parásitos/ml, se dejó incubar por 72 horas a 26 ˚C [58], luego adiciono MTT en la concentración que indico el proceso de optimización; se incubo 4 horas a 37˚C y adiciono el mejor disolvente para los cristales de formazan encontrado en este estudio. Se realizó lectura de absorbancia a 540nm en un lector de microplacas[54], [58]. 7.1.4 Análisis estadístico Los experimentos se realizaron por triplicado y las comparaciones entre múltiples grupos con respecto al control se realizaron utilizando un ANOVA unidireccional seguido de Dunnett's test [59], con el software de GraphPad Prism 8.0.2. Un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Para aquellos medicamentos que tuvieron un efecto de inhibición, se calculó la concentración media inhibitoria (IC50) utilizando regresión no lineal con ayuda del programa GraphPad Prism 8.0.2. 7.1.5 Generación de parásitos transfectados que expresen de manera constitutiva la GFP. Para la generación de parásitos que expresaran de manera constitutiva la proteina verde fluorescente (GFP) se partió del vector de expresión pSP72Rαneoα-GFP que contiene la secuencia del promotor del ARN ribosomal de L. braziliensis y de la proteina verde fluorescente (GFP) [60] . Se evaluó la integridad del plásmido con las enzimas de restricción (HindIII y BamHI). Procedimiento de electroporación: Para este experimento se obtuvieron los parásitos de 10ml de cultivo en fase exponencial, se centrifugaron a 1000g por 10 minutos a 4°C; se descartó el sobrenadante y adiciono 3ml de Cytomix (120 mM KCl, 25 mM Hepes pH7.6, 10 mM K2HPO4, 5 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 0.15 mM CaCl2) recién filtrado. Se homogenizo y centrifugo nuevamente a 1000g por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante fue descartado y adiciono la cantidad de Cytomix necesaria para que los parásitos alcanzaran a una concentración de 5x108 parásitos/μl, de los cuales se tomaron 200μl para adicionar a una celda de electroporación de 2mm con 50μg del vector previamente esterilizado a 80°C por 10 minutos. La solución anterior se incubo por 10 minutos sobre hielo y electroporó con tres pulsos de 1,6 Kv 25μF con intervalos de 20 segundos de reposo. El contenido de la celda se transfirió a una caja de cultivo celular con 5ml de medio Schneider 20% SBF. A las 24 horas se adiciono G418 (geneticina) a una concentración de 30 μg/ml. Se esperó una semana para hacer recambio de medio, centrifugando el contenido de la caja de cultivo celular a 1000g por 10 minutos a 4°C, se descartó el sobrenadante y suspendió el pellet en 5ml de medio Schneider con 20% SBF y 30 μg/ml de G418, el cultivo se tuvo en observación por 30 días. Nota, el procedimiento se realizó por duplicado. También se realizaron experimentos cambiando la electroporación a un pulso de 0,45 kV y 500 μF. 7.2 Metodología para evaluar el efecto de los inhibidores imidazólicos sobre la actividad de la LbNMNAT. 7.2.1 Análisis bioinformáticos del efecto de los inhibidores imidazolicos sobre la recombinante LbNMNAT. Se realizaron acoplamientos moleculares entre el modelo de la estructura terciaria la proteina generado con el predictor AlphaFold (base de datos Uniprot, con el número de acceso A0A3P3Z325) y los medicamentos evaluados, así como con los sustratos de la enzima. Para ello se utilizó la herramienta Autodok Vina 1.1.2 [61] ; la proteina y el ligando se prepararon con el paquete de AutoDockTools (ADT, v1.5.6) [62], y visualizaron con el software UCSF Chimera [63] y Maestro 10.3. 7.2.2 Expresión, extracción y purificación de la enzima recombinante LbNMNAT. Se siguieron los procedimientos descritos por Contreras Rodríguez et al., 2020, con modificaciones en la resina utilizada y composición de los buffers. Se utilizaron células de Escherichia coli (E. coli) M15 transformadas con el plásmido pQE30-LbNMNAT en un inoculo de 100 ml en medio LB con 100 μg/ml de ampicilina y 50 μg/ml de kanamicina, fueron inducidas con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM e incubabas a 26 ˚C durante la noche. Las células de los ensayos de inducción se centrifugaron 8000 rpm por 10 min a 4ºC, los precipitados se resuspendendieron en buffer de lisis (1 mg/ml lisozima, 300 mM NaCl, 25 mM NaH2PO4 pH 8.0/NaOH, 10 mM imidazol, 2 mM MgCl2, 2 mM β-mercaptoetanol, 1% V/V glicerol, coctel de inhibidores de proteasas Sigma P8340 en relación volumétrica 1:300). Se incubo 1 hora a 4ºC, en agitación. Posteriormente las muestras se sometieron a ultrasonido (pulsos de 15 segundos con 50 % de amplitud y 45 segundos de reposo, para un tiempo total de sonicación de 3 minutos) y se centrifugaron a 14000 rpm por 20 min a 4ºC; se separaron las fracciones solubles de las insolubles. Ya que el vector pQE30 le adiciona a la enzima recombinante una etiqueta de histidinas, como método de purificación se usó cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC). Los extractos solubles de la LbNMNAT se incubaron con la resina de cobalto (Cobalt Agarose Beads, Gold Biotechnology) equilibrada con buffer de unión, (300 mM NaCl, 25 mM NaH2PO4 pH 8.0/NaOH, 10 mM imidazol, 2 mM MgCl2, 1% V/V glicerol), se dejó incubar durante 1 h sobre hielo en agitación constante. La mezcla se centrifugo y retiro el sobrenadante. El precipitado fue lavado 3 veces con los buffers de lavado que contenían concentraciones crecientes de imidazol (300 mM NaCl, 25 mM NaH2PO4 pH 8.0/NaOH, 2 mM MgCl2, 1% V/V glicerol y concentraciones de 10, 20, 35 mM de imidazol para las soluciones de lavado 1, 2 y 3, respectivamente). Como último paso se realizaron 4 eluciones con 0.5 ml de buffer de elución (300 mM NaCl, 25 mM NaH2PO4 pH 8.0/NaOH, 2 mM MgCl2, 1% V/V glicerol, 300 mM imidazol). Los eludido se dializaron con 1000 ml de buffer de diálisis (300 mM NaCl, 25 mM NaH2PO4 pH 8.0/NaOH) [43] y se suplementaron con 1 mM DTT y 10 % V/V de glicerol. Se almacenaron alícuotas a -80 °C. Se cuantifico la cantidad de proteina por el método Bradford [64] y la purificación se evalúo por electroforesis SDS-PAGE en geles discontinuos [57] y tinciones con azul Coomassie coloidal (G-250). El procedimiento de purificación antes mencionado fue optimizado, modificando algunas de las condiciones que se hará mención en el apartado de resultados y discusión. 7.2.3 Evaluación de la actividad enzimática de la recombinante LbNMNAT y su uso en los ensayos de inhibición. Se determino la actividad enzimática de la recombinante LbNMNAT por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa (RP-HPLC), cuantificando los productos de la reacción de la LbNMNAT sobre sus sustratos [43]. Para los ensayos de inhibición, se adicionaron los derivados imidazolicos en concentraciones crecientes para determinar la capacidad inhibitoria que estos tienen sobre la actividad enzimática, in vitro (Figura 7-2). Figura 7-2: Esquema de las reacciones analizadas en cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa. En A se presenta el esquema de las reacciones para verificar la actividad de la LbNMNAT y en B, el esquema de su aplicación en los ensayos de inhibición. Los ensayos fuero realizados por triplicado, adaptando el protocolo descrito por Emanuelli et al., 1996 [65] a 37 °C. Se permitió la reacción por 10 minutos en buffer HEPES/KOH pH 7.4, 10 mM MgCl2, 1.25 mM ATP, 1.25 mM NMN y 5 μg de la enzima en un volumen final de 100 μl. La reacción fue detenida con 100 μl de HClO4 1.2 M, incubada por 15 minutos en hielo y centrifugada a 12.000g por 10 minutos. 150μl de la reacción anterior fue neutralizada con 40μl de K2CO3 1M, se incubo por 15 minutos en hielo y centrifugo a 12.000g por 10 minutos. 100 μl de sobrenadante fue analizado por RP-HPLC en una columna C18 de 25 cm de largo y 4.6mm de diámetro, con un tamaño de partícula de 5 μm, utilizando un cromatógrafo AGILENT 1260, bajo las condiciones indicadas por Contreras et al. [43], con algunas modificaciones: un flujo de 1ml por minutos y con las soluciones A: 0.1 mM de buffer fosfato de potasio, pH 6.0 y B: Metanol; se llevó a cabo el siguiente gradiente de elución: 2 minutos 100% de solución A, 1,5 minutos 20% de B, 3 minutos 25% de B y 3,5 minutos 100% de A. Los analitos fueron detectados a 254 nm y la concentración de NAD+ fue determinada utilizando el área de los picos y una curva de calibración construida con patrones conocidos de NAD+. 7.2.4 Análisis estadístico Los experimentos se realizaron por triplicado, las comparaciones entre múltiples grupos con respecto al control se realizaron utilizando un ANOVA unidireccional seguido de Dunnett's test [59], con el software de GraphPad Prism 8.0.2. Un valor p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. 7.3 Metodología para estudiar el efecto de la modificación postraducional de la LbNMNAT mediante el análisis de la actividad enzimática empleando mutantes fosfomiméticos. Para estudiar el efecto de la fosforilación en la estructura y función la LbNMNAT, se realizaron análisis bioinformáticos de la predicción de los sitios de fosforilación; así como de sus posibles efectos. También se llevaron a la fase experimenta metodologías que buscaron confirmar los hallazgos in silico; como la presencia de fosforilaciones en la LbNMNAT endógena con herramientas inmunológicas; y la sustitución de aminoácidos en la LbNMNAT recombinante, que se predicen pueden estar fosforilados, por aminoácidos que los mimetizan en su forma fosforilada, como se ha reportado para otras proteínas, serina/treonina por acido aspártico o glutámico y tirosina por acido glutámico [66] . 7.3.1 Aproximación bioinformática Con la secuencia de la proteina LbNMNAT, se confirmaron las predicciones bioinformáticas previas de los sitios de fosforilación, usando la herramienta NetPhos - 3.1 [67] y Phostryp [68], la cual es específica para tripanosomátidos. Una vez analizados estos datos, se comparó el sitio de fosforilación más probable en la estructura primaria de la proteina con las NMNAT de otras especies de Leishmania y las ortologas humanas, por medio de un alineamiento con el software CLC Sequence Viewer Version 8.0. A continuación, se generaron los modelos de las estructuras terciarias de las proteínas con los predictores ROBETTA [69] y ALFAFOLD2 [70]. Las estructuras se validaron con el plot de Ramachandran generado en el servidor Ramachandran plot server Ramachandran plot server [71]. El acoplamiento molecular entre la enzima y los sustratos adenosín trifosfato (ATP) y mononucleótido de nicotinamida (NMN) se realizaron con la herramienta Autodok Vina 1.1.2 [61] ; la proteina y el ligando se prepararon con el paquete de AutoDockTools (ADT, v1.5.6) [62], y visualizaron con el software UCSF Chimera [63]. 7.3.2 Exploración experimental de la existencia de fosforilaciones en la enzima LbNMNAT endógena de Leishmania braziliensis. Para llevar a cabo esta aproximación se realizó la inmunoprecipitación de la LbNMNAT endógena utilizando Anti His-LbNMNAT generados en investigaciones previas. [9] Protocolo inmunoprecipitación de la LbNMNAT endógena Se siguieron los protocolos descritos por Contreras Rodríguez, 2016 y Villamil Silva, 2021 con modificaciones. Utilizando anticuerpos anti-Lb-NMNAT-IgY purificados por afinidad, generados en estudios previos Lisis de los parásitos: Se Centrifugaron Aproximadamente 7.5x108 parásitos en fase exponencial por 10 min a 5000 rpm, se realizaron 3 lavados con PBS 1X. Se adiciono buffer de lisis (0.1% Tritón X100, cóctel inhibidor de proteasas Sigma a una dilución final de 1:250; coctel inhibidor de fosfatasas sigma I, a una dilución 1:100 y coctel inhibidor de fosfatasas sigma II, a una dilución 1:100). Se dejo en agitación 30 min a 4°C. Se realizaron 10 ciclos de congelamiento-descongelamiento y centrifugaron a 12000 rpm 20 min 4°C. Se recolecto y cuantifico la fracción soluble por el método de Bradford. Preparación de la resina: Se uso la resina tiofílica (Pierce® Thiophilic Adsorbent–Thermo Scientific). Se equilibran 400μL de ella con tres lavados de 300 μl de buffer IP 2X (Tris-HCL 50Mm pH 7.5, NaCl 150Mm, MgCl2 5mM y Glicerol 5% v/v). Dejando interactuar la resina con el buffer por 10min a 4°C y luego centrifugo a 2.000 rpm por 3 minutos a 4°C, en cada caso. La resina se distribuyó en dos eppendorf de 1,5ml con 200μL de resina en cada uno. Aclarado: Se permitió la interacción de 2mg de fracción proteica soluble de promastigotes de L. braziliensis mezclada en relación 1:1 con buffer IP 2x, con 200μL de la resina durante 3h a 4°C en agitación constante, luego, se centrifuga a 2000rpm durante 3min a 4°C. se Tomaron 50 μl del sobrenadante para SDS-PAGE (aclarado). El sobrenadante fue transferido a un eppendorf nuevo de 1,5mL, adicionando 4mg de anti-Lb-NMNAT-IgY (4mg de Ig-Y por cada 200 μl de resina), se permitió la interacción toda la noche en agitación constante a 4°C. Se adicionaron los 200μL de resina restante. Aclarado, anticuerpo y resina se incubaron 2h a 4°C en agitación constante. Se centrifugo a 2.000rpm durante 3min a 4°C y tomo el sobrenadante como (no unidas). Con el precipitado se realizaron 3 lavados con 500μL de buffer IP 2x cada uno de 10min a 4°C en agitación y centrifugaciones de 2.000 rpm a 4°C, conservando parte del sobrenadante para seguimiento. Para liberar la proteina inmunoprecipitada: se resuspende el precipitado en 200μL de buffer de carga para SDS-PAGE1X, calentado a 96°C durante 10min y se centrifuga a 3000rpm durante 3min a 4 °C. El sobrenadante se conserva como Inmunoprecipitado (IP). Se monitoreo el proceso mediante SDS-PAGE 10% con tinción de plata. Análisis de la inmunoprecipitación de la LbNMNAT endógena mediante Western blot. Las muestras de la inmunoprecipitación se separaron mediante SDS-PAGE en geles discontinuos y se transfirieron hacia membranas PVDF (Millipore) aplicando una corriente de 200 mA por 2 horas en buffer de transferencia (0.2 M glicina, 10 mM Tris/HCl pH 8.0, 10% (V/V) metanol). Se evaluó la transferencia con solución de tinción reversible Ponceau S. Luego las membranas se bloquearon 2 horas con TBST-Leche 2% (P/V) en TBS-Tween (150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 7.5, 0.1% (V/V) Tween 20). La inmunodetección de la proteína recombinante se realizó con el anticuerpo primario 6XHisLbNMNAT IgYs y el anticuerpo secundario Anti IgYs Fosfatasa alcalina (1:10000). Se detecto con streptavidina A conjugada a fosfatasa alcalina (1:3000) (Promega) y los sustratos nitro-azul de tetrazolio (NBT) (50mg/ml) y 5-bromo-4-cloro-3’-indoilfosfato (BCIP) (50mg/ml) (Promega) en buffer sustrato (150 mM NaCl, 100 mM Tris/HCl pH 9.0, 1 mM MgCl2). Se detuvo la reacción con agua destilada al evidenciar la detección. Se realizaron lavados sobre las membranas entre los cambios de anticuerpos y después de adicionar la fosfatasa alcalina [9] Inmunodetección de la fosforilación en los residuos de serina de la LbNMNAT endógena mediante anticuerpos αS-fosforilada (anti-fosfoserina). En el caso de la inmunodetección de la proteina fosforilada usando los anticuerpos antifosfoserina (Sigma), se usó en mismo procedimiento para el análisis de la inmunoprecipitación descrito en el apartado anterior con los siguientes cambios: se realizó bloqueo con TBST-BSA 2%, anticuerpo primario αS-fosforilada (1:1000) y secundario anti-mouse biotina (1:8000) estreptavidina-Fosfatasa (1:5000), sustrato NTB [72] 7.3.3 Aproximación experimental: Diseño y creación del mutante mimético. A partir del vector de expresión pQE30-LbNMNAT obtenido previamente [73], el cual adiciona una etiqueta de histidinas a la LbNMNAT, se generó mediante mutagénesis dirigida el mutante miméticos, como se describe a continuación.  Extracción de ADN plasmídico por hidrolisis alcalina: Se dejó crecer un inoculo de bacterias que contienen el plásmido a extraer, en medio LB suplementado con ampicilina (100 μg/ml) durante 12 h a 37°C, en agitación constante; esta suspensión de células se centrifugo 6000 rpm por 10 minutos. El precipitado se resuspendió en 300 μl de solución I (glucosa 50 mM, Tris-HCl 25mM, EDTA 10 mM pH 8.0), luego se liso con 300 μl de solución II (NaOH 0.2 N, SDS 1%) y se neutralizo con 300 μl solución III (acetato de potasio 3 M pH 4.8). La mezcla obtenida se centrifugo a 10000 rpm por 10 minutos, se tomó el sobrenadante y adiciono RNAsa e incubo por 30 min a 37°C [74]. Después, se realizó la purificación del ADN plasmídico por el método de fenol cloroformo y se precipita el ADN con etanol [57] . Generación de la versión mutada de la enzima LbNMNAT: A partir del vector de expresión pQE30-LbNMNAT obtenido previamente [75] y mediante mutagénesis dirigida, se generó el cambio del aminoácido serina 210, que se predice es blanco de fosforilación, por un ácido aspártico; el cual, por su carga negativa, mimetiza el efecto del primero en estado fosforilado. Para este objetivo se utilizó el kit QuikChange II Site-Directed Mutagenesis de Agilent, con los primers directo 5'- GCT CGA GGC AAC ATC GAC GAC TCC GAT GAC TTC -3' y reverso 5'- GAA GTC ATC GGA GTC GTC GAT GTT GCC TCG AGC -3’ diseñados con la herramienta QuikChange Primer Design de Agilent. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50 μl que contenían 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 2 mM MgSO4, 0,1% Triton® X-100, 0,1 mg/ml de albumina de suero Bovino libre de nucleasas, la concentración de dNTPs indicada por la casa comercial y 1 μl de ADN polimerasa PfuTurbo (2.5 U/μl). Se utilizó el siguiente perfil térmico: desnaturalización inicial de 95°C, 30 segundos (s) y 16 ciclos de desnaturalización a 95°C, 30s; anillaje a 55°C, 1minuto (min) y extensión a 68°C 4 min con 30s. Los productos se separaron por electroforesis en geles de agarosa 1% (P/V) utilizando buffer TBE 0.5 X (44.5mM Tris, 44.5 mM Borato, 0.025 mM EDTA), revelando los geles con tinción de bromuro de etidio 0.05% (V/V). Al producto PCR se le adiciono 1 μl de la enzima Dpn I (10 μl U/μl) Thermo Scientific, para digerir el ADN platilla metilado. Posteriormente este ADN fue utilizado para transformar células E. coli competentes XL-1 Blue, mediante choque térmico [57]. Los clones resultantes se inocularon en placas de medio LB suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina, dejando incubar por 24 horas a 37°C. Las colonias resultantes fueron evaluadas por PCR de colonia que identificaba la LbNMNAT en el plásmido, bajo las condiciones ya estandarizadas [9]. Se extrajo el plásmido que contenía la versión mutada de la enzima (LbNMNAT S210D) de las células XL-1 blue por medio de lisis alcalina [57]; el producto fue secuenciado para confirmar la mutación y utilizado para transformar células E. coli M15 competentes mediante choque térmico. Los clones resultantes se sembraron medio LB suplementados con 100 μg/ml de ampicilina y 50 μg/ml de kanamicina. La transformación se verifico con el procedimiento de PCR de colonia ya descrito. La expresión purificación y evaluación catalítica de las LbNMNAT con mimetismos de fosforilación, se llevarán a cabo tomando como guía las condiciones utilizadas para la enzima silvestre, como se explicó previamente. Los procedimientos de expresión y purificación también se realizaron con la LbNMNAT nativa, como control experimental.Bioquímicaxiii, 79 páginasapplication/pdfspaUniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - BioquímicaFacultad de CienciasBogotá,ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá610 - Medicina y salud::616 - EnfermedadesSalud públicaBiología molecularPublic HealthLecular BiologyLeishmania braziliensisNicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasaMutantes fosfomiméticosNicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyl transferasePhosphomimetic mutantsEstudio de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de leishmania braziliensis (LbNMNAT): Hacia la caracterización de un potencial blanco quimioterapéuticoStudy of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyl transferase of leishmania braziliensis (LbNMNAT): Tower the characterization of a potential chemotherapeutic targetTrabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TM[1] G. Herrera, A. Teherán, I. Pradilla, M. Vera, y J. D. Ramírez, «Geospatial-temporal distribution of Tegumentary Leishmaniasis in Colombia (2007–2016)», PLoS Negl Trop Dis, vol. 12, n.o 4, abr. 2018, doi: 10.1371/journal.pntd.0006419.[2] L. E. Contreras, R. Neme, y M. H. Ramírez, «Identification and functional evaluation of Leishmania braziliensis Nicotinamide Mononucleotide Adenylyltransferase», Protein Expr Purif, vol. 115, pp. 26-33, nov. 2015, doi: 10.1016/j.pep.2015.08.022.[3] S. A. Pulido et al., «Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs», Acta Trop, vol. 122, n.o 1, pp. 36-45, abr. 2012, doi: 10.1016/j.actatropica.2011.11.015.[4] T. Pineda, Y. Valencia, M. F. Flórez, S. A. Pulido, I. D. Vélez, y S. M. Robledo, «A non-commercial approach for the generation of transgenic Leishmania tarentolae and its application in antileishmanial drug discovery», Parasitology, vol. 143, n.o 9, pp. 1133-1142, ago. 2016, doi: 10.1017/S0031182016000585.[5] O. P. de la Salud, «Leishmaniasis: Informe Epidemiológico de las Américas, No. 10 (Diciembre 2021)», Informe de Leishmaniasis, dic. 2021, Accedido: 15 de octubre de 2022. [En línea]. Disponible en: https://iris.paho.org/handle/10665.2/55344[6] V. V. Andrade-Neto, H. L. de Matos-Guedes, D. C. de O. Gomes, M. M. do Canto- Cavalheiro, B. Rossi-Bergmann, y E. C. Torres-Santos, «The stepwise selection for ketoconazole resistance induces upregulation of C14-demethylase (CYP51) in Leishmania amazonensis», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 107, n.o 3, pp. 416-419, may 2012, doi: 10.1590/S0074-02762012000300018.[7] S. L. Croft, S. Sundar, y A. H. Fairlamb, «Drug resistance in leishmaniasis», Clin Microbiol Rev, vol. 19, n.o 1, pp. 111-126, ene. 2006, doi: 10.1128/CMR.19.1.111- 126.2006.[8] J. Chakravarty y S. Sundar, «Drug Resistance in Leishmaniasis», J Glob Infect Dis, vol. 2, n.o 2, p. 167, 2010, doi: 10.4103/0974-777X.62887.[9] L. E. Contreras Rodríguez, «Obtención y caracterización bioquímica y funcional de la enzima recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT)», Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, 2016.[10] C. G. Granados Ramírez, L. E. Contreras Rodríguez, O. L. J. Joya, y M. H. Ramírez Hernández, «Efecto inhibitorio del imidazol sobre la actividad de la NMNAT de Leishmania braziliensis», en Libro de Memorias Del Segundo Congreso Colombiano de Bioquímica y Biología Molecular. Medellín Colombia. ISBN 978-958-59491-1-9., 2016, p. 253.[11] R. L. Charlton, B. Rossi-Bergmann, P. W. Denny, y P. G. Steel, «Repurposing as a strategy for the discovery of new anti-leishmanials: the-state-of-the-art», Parasitology, vol. 145, n.o 2, p. 219, feb. 2018, doi: 10.1017/S0031182017000993.[12] H. V. Tolomeu y C. A. M. Fraga, «Imidazole: Synthesis, Functionalization and Physicochemical Properties of a Privileged Structure in Medicinal Chemistry», Molecules, vol. 28, n.o 2, ene. 2023, doi: 10.3390/MOLECULES28020838.[13] L. J. Ortiz Joya, «Caracterización de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT) mediante análisis estructural y de interacción proteína-proteína», Universidad Nacional de Colombia, 2017.[14] W. H. Organization, «Control of the leishmaniases. Report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases, Geneva, 22–26 March 2010», World Health Organ Tech Rep Ser, n.o 949, pp. xii-xiii, 1-186, back cover, 2010.[15] P. A. Bates, «Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies», International Journal for Parasitology, vol. 37, n.o 10. Pergamon, pp. 1097-1106, 1 de agosto de 2007. doi: 10.1016/j.ijpara.2007.04.003.[16] M. Akhoundi et al., «A Historical Overview of the Classification, Evolution, and Dispersion of Leishmania Parasites and Sandflies», PLoS Neglected Tropical Diseases, vol. 10, n.o 3. Public Library of Science, 3 de marzo de 2016. doi: 10.1371/journal.pntd.0004349.[17] B. Zulfiqar, T. B. Shelper, y V. M. Avery, «Leishmaniasis drug discovery: recent progress and challenges in assay development», Drug Discovery Today, vol. 22, n.o 10. Elsevier Ltd, pp. 1516-1531, 1 de octubre de 2017. doi: 10.1016/j.drudis.2017.06.004.[18] D. Pace, «Leishmaniasis», Journal of Infection, vol. 69, n.o S1, pp. S10-S18, nov. 2014, doi: 10.1016/j.jinf.2014.07.016.[19] Pan American Health Organization, Manual of procedures for surveillance and control of leishmaniasis in the Americas. PAHO/WHO, 2019.[20] «Leishmaniasis». https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/leishmaniasis (accedido 15 de octubre de 2022).[21] PubChem, «Nadide \| C21H27N7O14P2 - PubChem». https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5892 (accedido 8 de mayo de 2020).[22] M. Arenas-Jal, J. M. Suñé-Negre, y E. García-Montoya, «Therapeutic potential of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)», Eur J Pharmacol, vol. 879, p. 173158, jul. 2020, doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173158.[23] M. Pehar, B. A. Harlan, K. M. Killoy, y M. R. Vargas, «Nicotinamide Adenine Dinucleotide Metabolism and Neurodegeneration», Antioxidants and Redox Signaling, vol. 28, n.o 18. Mary Ann Liebert Inc., pp. 1652-1668, 20 de junio de 2018. doi: 10.1089/ars.2017.7145.[24] C. Cantó, K. J. Menzies, y J. Auwerx, «NAD+ Metabolism and the Control of Energy Homeostasis: A Balancing Act between Mitochondria and the Nucleus», Cell Metabolism, vol. 22, n.o 1. Cell Press, pp. 31-53, 7 de julio de 2015. doi: 10.1016/j.cmet.2015.05.023.[25] I. Mesquita et al., «Exploring NAD+ metabolism in host-pathogen interactions», Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 73, n.o 6. Birkhauser Verlag AG, pp. 1225- 1236, 1 de marzo de 2016. doi: 10.1007/s00018-015-2119-4.[26] A. S. Marletta, A. Massarotti, G. Orsomando, G. Magni, M. Rizzi, y S. Garavaglia, «Crystal structure of human nicotinic acid phosphoribosyltransferase», FEBS Open Bio, vol. 5, pp. 419-428, ene. 2015, doi: 10.1016/j.fob.2015.05.002.[27] R. Capela, R. Moreira, y F. Lopes, «An overview of drug resistance in protozoal diseases», International Journal of Molecular Sciences, vol. 20, n.o 22. MDPI AG, 2 de noviembre de 2019. doi: 10.3390/ijms20225748.[28] S. Emami, P. Tavangar, y M. Keighobadi, «An overview of azoles targeting sterol 14α-demethylase for antileishmanial therapy», European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 135. Elsevier Masson SAS, pp. 241-259, 2017. doi: 10.1016/j.ejmech.2017.04.044.[29] P. R. Murumkar y R. B. Ghuge, «Vicinal Diaryl Oxadiazoles, Oxazoles, and Isoxazoles», en Vicinal Diaryl Substituted Heterocycles, Elsevier, 2018, pp. 277-303. doi: 10.1016/B978-0-08-102237-5.00009-2.[30] N. Martínez-Matías y J. R. Rodríguez-Medina, «• REVIEW ARTICLE • Fundamental Concepts of Azole Compounds and Triazole Antifungals: A Beginner’s Review», 2018.[31] S. S. Braga, «Multi-target drugs active against leishmaniasis: A paradigm of drug repurposing», European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 183. Elsevier Masson SAS, 1 de diciembre de 2019. doi: 10.1016/j.ejmech.2019.111660.[32] J. S. de Araújo et al., «Imidazole derivatives as promising agents for the treatment of Chagas disease», Antimicrob Agents Chemother, vol. 63, n.o 4, abr. 2019, doi: 10.1128/AAC.02156-18.[33] C. M. Cuesta y J. A. Hernández, «Desarrollo de nuevos fármacos en parasitología», en Parasitología médica, 5e, M. A. B. Flores, Ed., New York, NY: McGraw-Hill Education, 2019.[34] R. G. Zhai, M. Rizzi, y S. Garavaglia, «Nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase, new insights into an ancient enzyme», Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 66, n.o 17. Cell Mol Life Sci, pp. 2805-2818, septiembre de 2009. doi: 10.1007/s00018-009-0047-x.[35] C. Cui, J. Qi, Q. Deng, R. Chen, D. Zhai, y J. Yu, «Nicotinamide Mononucleotide Adenylyl Transferase 2: A Promising Diagnostic and Therapeutic Target for Colorectal Cancer», Biomed Res Int, vol. 2016, 2016, doi: 10.1155/2016/1804137.[36] M. Ginouves, B. Carme, P. Couppie, y G. Prevot, «Comparison of tetrazolium salt assays for evaluation of drug activity against leishmania spp.», J Clin Microbiol, vol. 52, n.o 6, pp. 2131-2138, 2014, doi: 10.1128/JCM.00201-14.[37] M. Ginouves, B. Carme, P. Couppie, y G. Prevot, «Comparison of tetrazolium salt assays for evaluation of drug activity against leishmania spp.», J Clin Microbiol, vol. 52, n.o 6, pp. 2131-2138, 2014, doi: 10.1128/JCM.00201-14.[38] S. Gupta y Nishi, «Visceral leishmaniasis: Experimental models for drug discovery», Indian Journal of Medical Research, vol. 133, n.o 1. Wolters Kluwer -- Medknow Publications, pp. 27-39, enero de 2011.[39] J. R. Haanstra, E. B. González-Marcano, M. Gualdrón-López, y P. A. M. Michels, «Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites», Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, vol. 1863, n.o 5. Elsevier B.V., pp. 1038-1048, 1 de mayo de 2016. doi: 10.1016/j.bbamcr.2015.09.015.[40] A. A. Religa y A. P. Waters, «Sirtuins of parasitic protozoa: In search of function(s)», Molecular and Biochemical Parasitology, vol. 185, n.o 2. Elsevier, pp. 71-88, octubre de 2012. doi: 10.1016/j.molbiopara.2012.08.003.[41] S. K. Ardestani et al., «Cell death features induced in Leishmania major by 1,3,4- thiadiazole derivatives», Exp Parasitol, vol. 132, n.o 2, pp. 116-122, oct. 2012, doi: 10.1016/j.exppara.2012.06.002.[42] L. E. Contreras Rodríguez, R. Neme, y M. H. Ramírez, «Aproximación al Metabolismo del Dinucleótido de Nicotinamida y Adenina (NAD+) en Leishmania», Revista de la Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas, vol. 22, pp. 97-112, 2010.[43] L. E. Contreras Rodríguez, M. Ziegler, y M. H. Ramírez Hernández, «Kinetic and oligomeric study of Leishmania braziliensis nicotinate/nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase», Heliyon, vol. 6, n.o 4, p. e03733, abr. 2020, doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e03733.[44] L. Ortiz-Joya, L. E. Contreras-Rodríguez, y M. H. Ramírez-Hernández, «Proteinprotein interactions of the nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase of leishmania braziliensis», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 114, n.o 2, feb. 2019, doi: 10.1590/0074-02760180506.[45] S. P. Georgiadou, K. P. Makaritsis, y G. N. Dalekos, «Leishmaniasis revisited: Current aspects on epidemiology, diagnosis and treatment», J Transl Int Med, vol. 3, n.o 2, pp. 43-50, dic. 2016, doi: 10.1515/jtim-2015-0002.[46] E. L. Galvão, A. Rabello, y G. F. Cota, «Efficacy of azole therapy for tegumentary leishmaniasis: A systematic review and meta-analysis», PLoS One, vol. 12, n.o 10, oct. 2017, doi: 10.1371/journal.pone.0186117.[47] V. V. Andrade-Neto et al., «Leishmaniasis treatment: Update of possibilities for drug repurposing», Frontiers in Bioscience - Landmark, vol. 23, n.o 5, pp. 967-996, ene. 2018, doi: 10.2741/4629.[48] R. L. Charlton, B. Rossi-Bergmann, P. W. Denny, y P. G. Steel, «Repurposing as a strategy for the discovery of new anti-leishmanials: The-state-of-the-art», Parasitology, vol. 145, n.o 2. Cambridge University Press, pp. 219-236, 1 de febrero de 2018. doi: 10.1017/S0031182017000993.[49] J. A. R. Vargas, A. G. Lopez, M. C. Piñol, y M. Froeyen, «Molecular docking study on the interaction between 2-substituted-4,5-difuryl Imidazoles with different Protein Target for antileishmanial activity», J Appl Pharm Sci, vol. 8, n.o 3, pp. 014-022, mar. 2018, doi: 10.7324/JAPS.2018.8303.[50] A. Kumar, S. C. Pandey, y M. Samant, «Slow pace of antileishmanial drug development», Parasitol Open, vol. 4, 2018, doi: 10.1017/pao.2018.1.[51] A. Niño y M. Camacho, «Leishmania (Viannia) braziliensis growth in vitro culture relies more on folic acid availability than Leihsmania (Leishmania) amazonensis», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 100, n.o 3, pp. 309-310, 2005, doi: 10.1590/S0074- 02762005000300017.[52] M. E. Forero, M. Marín, A. Corrales, I. Llano, H. Moreno, y M. Camacho, «Leishmania amazonensis infection induces changes in the electrophysiological properties of macrophage-like cells», Journal of Membrane Biology, vol. 170, n.o 2, pp. 173-180, 1999, doi: 10.1007/s002329900547.[53] B. J. Celeste y M. C. Guimarães, «Growth curves of Leishmania braziliensis braziliensis promastigotes and surface antigen expression before and after adaptation to Schneider’s Drosophila medium as assessed by anti-Leishmania human sera.», Rev Inst Med Trop Sao Paulo, vol. 30, n.o 2, pp. 63-67, mar. 1988, doi: 10.1590/S0036-46651988000200001.[54] T. Mosmann, «Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays», 1983.[55] S. Rahimi et al., «The leishmanicidal effect of Lucilia sericata larval saliva and hemolymph on in vitro Leishmania tropica», Parasit Vectors, vol. 14, n.o 1, pp. 1-12, dic. 2021, doi: 10.1186/S13071-020-04543-Y/TABLES/5.[56] S. Muelas-Serrano, J. J. Nogal-Ruiz, y A. Gómez-Barrio, «Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes», Parasitol Res, vol. 86, n.o 12, pp. 999-1002, 2000, doi: 10.1007/PL00008532.[57] J. Sambrook y Russell D.W, Molecular Cloning: A Labortaroy Manual. 2001. doi: 10.1128/AEM.68.3.1232.[58] A. Dutta, S. Bandyopadhyay, C. Mandal, y M. Chatterjee, «Development of a modified MTT assay for screening antimonial resistant field isolates of Indian visceral leishmaniasis», Parasitol Int, vol. 54, n.o 2, pp. 119-122, 2005, doi: 10.1016/j.parint.2005.01.001.[59] B. S. Borges, G. de P. Bueno, F. Tomiotto-Pellissier, F. B. Figueiredo, y L. C. Soares Medeiros, «In vitro anti-Leishmania activity of triclabendazole and its synergic effect with amphotericin B», Front Cell Infect Microbiol, vol. 12, ene. 2023, doi: 10.3389/FCIMB.2022.1044665/FULL.[60] V. D. Atayde, E. Ullu, y N. G. Kolev, «A single-cloning-step procedure for the generation of RNAi plasmids producing long stem-loop RNA», Mol Biochem Parasitol, vol. 184, n.o 1, p. 55, jul. 2012, doi: 10.1016/J.MOLBIOPARA.2012.04.003.[61] O. Trott y A. J. Olson, «AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading», J Comput Chem, vol. 31, n.o 2, p. 455, ene. 2010, doi: 10.1002/JCC.21334.[62] M. F. Sanner, «Python: a programming language for software integration and development - PubMed», Journal of molecular graphics & modelling, 1999. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10660911/ (accedido 24 de enero de 2022).[63] E. F. Pettersen et al., «UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis», J Comput Chem, vol. 25, n.o 13, pp. 1605-1612, oct. 2004, doi: 10.1002/JCC.20084.[64] M. Bradford, «A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding», Anal Biochem, vol. 72, n.o 1-2, pp. 248-254, may 1976, doi: 10.1006/abio.1976.9999.[65] M. Emanuelli, N. Raffaelli, A. Amici, M. Fanelli, S. Ruggieri, y G. Magni, «Threeminute high-performance liquid chromatographic assay for NMN adenylyltransferase using a 20-mm-long reversed-phase column», J Chromatogr B Biomed Sci Appl, vol. 676, n.o 1, pp. 13-18, feb. 1996, doi: 10.1016/0378-4347(95)00408-4.[66] R. Levy, E. Gregory, W. Borcherds, y G. Daughdrill, «p53 phosphomimetics preserve transient secondary structure but reduce binding to Mdm2 and MdmX», Biomolecules, vol. 9, n.o 3, p. 83, mar. 2019, doi: 10.3390/biom9030083.[67] N. Blom, S. Gammeltoft, y S. Brunak, «Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites», J Mol Biol, vol. 294, n.o 5, pp. 1351-1362, dic. 1999, doi: 10.1006/jmbi.1999.3310.[68] A. Palmeri et al., «PhosTryp: a phosphorylation site predictor specific for parasitic protozoa of the family trypanosomatidae», BMC Genomics, vol. 12, p. 614, dic. 2011, doi: 10.1186/1471-2164-12-614.[69] M. Baek et al., «Accurate prediction of protein structures and interactions using a 3- track neural network», Science, vol. 373, n.o 6557, p. 871, ago. 2021, doi: 10.1126/SCIENCE.ABJ8754.[70] M. Mirdita, K. Schütze, Y. Moriwaki, L. Heo, S. Ovchinnikov, y M. Steinegger, «ColabFold: making protein folding accessible to all», Nature Methods 2022 19:6, vol. 19, n.o 6, pp. 679-682, may 2022, doi: 10.1038/s41592-022-01488-1.[71] R. J. Anderson, Z. Weng, R. K. Campbell, y X. Jiang, «Main-chain conformational tendencies of amino acids», Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, vol. 60, n.o 4, pp. 679-689, sep. 2005, doi: 10.1002/PROT.20530.[72] D. M. Sánchez-Lancheros, L. F. Ospina-Giraldo, y M. H. Ospina-Giraldo, «Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase of Trypanosoma cruzi (TcNMNAT): a cytosol protein target for serine kinases», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 111, n.o 11, pp. 670-675, nov. 2016, doi: 10.1590/0074-02760160103.[73] L. E. Contreras Rodríguez, «Obtención y caracterización bioquímica y funcional de la enzima recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT)», 2016.[74] J. Engebrecht, R. Brent, y M. A. Kaderbhai, Minipreps of Plasmid DNA, vol. 15, n.o 1. Wiley, 2001. doi: 10.1002/0471142727.mb0106s15.[75] L. E. Contreras Rodríguez, «Obtención y caracterización bioquímica y funcional de la enzima recombinante nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT)», 2016.[76] M. Ghasemi, T. Turnbull, S. Sebastian, y I. Kempson, «The mtt assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis», Int J Mol Sci, vol. 22, n.o 23, dic. 2021, doi: 10.3390/IJMS222312827/S1.[77] Software GraphPad Prism, «Equation: Exponential growth». https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/curvefitting/ reg_exponential_growth.htm (accedido 12 de febrero de 2023).[78] A. S. Nagle et al., «Recent developments in drug discovery for leishmaniasis and human african trypanosomiasis», Chem Rev, vol. 114, n.o 22, pp. 11305-11347, nov. 2014, doi: 10.1021/CR500365F/ASSET/IMAGES/LARGE/CR-2014- 00365F_0012.JPEG.[79] A. Shokri et al., «Promising antileishmanial activity of novel imidazole antifungal drug luliconazole against Leishmania major: In vitro and in silico studies», J Glob Antimicrob Resist, vol. 14, pp. 260-265, sep. 2018, doi: 10.1016/J.JGAR.2018.05.007.[80] D. C. de O. S. Nunes et al., «Mitochondrial dysfunction on Leishmania (Leishmania) amazonensis induced by ketoconazole: insights into drug mode of action», Mem Inst Oswaldo Cruz, vol. 117, 2022, doi: 10.1590/0074-02760210157.[81] M. L. Kennedy et al., «Leishmanicidal and reversal multidrug resistance constituents from Aeonium lindleyi», Planta Med, vol. 77, n.o 1, pp. 77-80, 2011, doi: 10.1055/S- 0030-1250144.[82] R. E. Saenz, H. Paz, y J. D. Berman, «Efficacy of ketoconazole against Leishmania braziliensis panamensis cutaneous leishmaniasis», Am J Med, vol. 89, n.o 2, pp. 147- 155, 1990, doi: 10.1016/0002-9343(90)90292-L.[83] L. K. Rushworth et al., «Repurposing screen identifies mebendazole as a clinical candidate to synergise with docetaxel for prostate cancer treatment», Br J Cancer, vol. 122, n.o 4, p. 517, feb. 2020, doi: 10.1038/S41416-019-0681-5.[84] «JPMA - Journal Of Pakistan Medical Association». https://jpma.org.pk/articledetails/ 5571?article_id=5571 (accedido 30 de enero de 2023).[85] C. Alauzet, A. Lozniewski, y H. Marchandin, «Metronidazole resistance and nim genes in anaerobes: A review», Anaerobe, vol. 55. Academic Press, pp. 40-53, 1 de febrero de 2019. doi: 10.1016/j.anaerobe.2018.10.004.[86] A. Naif, H. Hasan, y K. Kadhim, «Metronidazole versus Pentostam for treatment of cutaneous leishmaniasis», Gazzetta Medica Italiana Archivio per le Scienze Mediche, vol. 177, n.o 11, pp. 611-616, nov. 2018, doi: 10.23736/S0393- 3660.17.03627-0.[87] J. S. Keithly y S. G. Langreth, «Inefficacy of Metronidazole in Experimental Infections of Leishmania Donovani, L. Mexicana, and Trypanosoma Brucei Brucei», Am J Trop Med Hyg, vol. 32, n.o 3, pp. 485-496, may 1983, doi: 10.4269/AJTMH.1983.32.485.[88] D. Leitsch, «A review on metronidazole: an old warhorse in antimicrobial chemotherapy», Parasitology, vol. 146, n.o 9, pp. 1167-1178, ago. 2019, doi: 10.1017/S0031182017002025.[89] M. P. Deutscher, «Chapter 10 Maintaining Protein Stability», Methods Enzymol, vol. 463, n.o C, pp. 121-127, ene. 2009, doi: 10.1016/S0076-6879(09)63010-X[90] R. R. Burgess, «Chapter 17 Refolding Solubilized Inclusion Body Proteins», Methods Enzymol, vol. 463, n.o C, pp. 259-282, ene. 2009, doi: 10.1016/S0076- 6879(09)63017-2.[91] W. W. Cleland, «DITHIOTHREITOL, A NEW PROTECTIVE REAGENT FOR SH GROUPS», Biochemistry, vol. 3, n.o 4, pp. 480-482, abr. 1964, doi: 10.1021/BI00892A002.[92] V. M. Bolanos-Garcia y O. R. Davies, «Structural analysis and classification of native proteins from E. coli commonly co-purified by immobilised metal affinity chromatography», Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1760, n.o 9, pp. 1304-1313, sep. 2006, doi: 10.1016/J.BBAGEN.2006.03.027.[93] R. Petrelli, K. Felczak, y L. Cappellacci, «NMN/NaMN adenylyltransferase (NMNAT) and NAD kinase (NADK) inhibitors: chemistry and potential therapeutic applications», Curr Med Chem, vol. 18, n.o 13, pp. 1973-1992, may 2011, doi: 10.2174/092986711795590048.[94] G. Indrayanto, G. S. Putra, y F. Suhud, «Validation of in-vitro bioassay methods: Application in herbal drug research», Profiles Drug Subst Excip Relat Methodol, vol. 46, pp. 273-307, ene. 2021, doi: 10.1016/BS.PODRM.2020.07.005.[95] G. W. Caldwell, Z. Yan, W. Lang, y J. A. Masucci, «The IC(50) concept revisited», Curr Top Med Chem, vol. 12, n.o 11, pp. 1282-1290, may 2012, doi: 10.2174/156802612800672844.[96] C. G. Granados-Ramírez, L. E. Contreras-Rodríguez, y M. H. Ramírez-Hernández, «Optimización del ensayo de inhibición de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenililtransferasa de Leishmania braziliensis», Rev Acad Colomb Cienc Exactas Fis Nat, vol. 45, n.o 176, pp. 721-730, jul. 2021, doi: 10.18257/RACCEFYN.1272.[97] L. F. Lye et al., «Retention and Loss of RNA Interference Pathways in Trypanosomatid Protozoans», PLoS Pathog, vol. 6, n.o 10, p. e1001161, oct. 2010, doi: 10.1371/JOURNAL.PPAT.1001161.[98] K. K. Ojo et al., «Glycogen Synthase Kinase 3 Is a Potential Drug Target for African Trypanosomiasis Therapy», Antimicrob Agents Chemother, vol. 52, n.o 10, p. 3710, oct. 2008, doi: 10.1128/AAC.00364-08.[99] K. K. Ojo et al., «Structure determination of glycogen synthase kinase-3 from Leishmania major and comparative inhibitor structure–activity relationships with Trypanosoma brucei GSK-3», Mol Biochem Parasitol, vol. 176, n.o 2, pp. 98-108, abr. 2011, doi: 10.1016/J.MOLBIOPARA.2010.12.009.[100] A. Efstathiou y D. Smirlis, «Leishmania Protein Kinases: Important Regulators of the Parasite Life Cycle and Molecular Targets for Treating Leishmaniasis», Microorganisms, vol. 9, n.o 4, abr. 2021, doi: 10.3390/MICROORGANISMS9040691.[101] E. Xingi et al., «6-Br-5methylindirubin-3′oxime (5-Me-6-BIO) targeting the leishmanial glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) short form affects cell-cycle progression and induces apoptosis-like death: Exploitation of GSK-3 for treating leishmaniasis», Int J Parasitol, vol. 39, n.o 12, pp. 1289-1303, oct. 2009, doi: 10.1016/J.IJPARA.2009.04.005.[102] J. Guo y H. X. Zhou, «Protein Allostery and Conformational Dynamics», Chem Rev, vol. 116, n.o 11, p. 6503, jun. 2016, doi: 10.1021/ACS.CHEMREV.5B00590.[103] L. Uhrik et al., «Allosteric changes in HDM2 by the ATM phosphomimetic S395D mutation: implications on HDM2 function», Biochemical Journal, vol. 476, n.o 21, p. 3401, nov. 2019, doi: 10.1042/BCJ20190687.[104] Y. O. Ali, R. McCormack, A. Darrand, y R. G. Zhai, «Nicotinamide Mononucleotide Adenylyltransferase Is a Stress Response Protein Regulated by the Heat Shock Factor/Hypoxia-inducible Factor 1α Pathway», J Biol Chem, vol. 286, n.o 21, p. 19089, may 2011, doi: 10.1074/JBC.M111.219295.[105] E. Schastnaya et al., «Extensive regulation of enzyme activity by phosphorylation in Escherichia coli», Nature Communications 2021 12:1, vol. 12, n.o 1, pp. 1-11, sep. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-25988-4.[106] B. Macek et al., «Phosphoproteome analysis of E. coli reveals evolutionary conservation of bacterial Ser/Thr/Tyr phosphorylation», Mol Cell Proteomics, vol. 7, n.o 2, pp. 299-307, feb. 2008, doi: 10.1074/MCP.M700311-MCP200.[107] E. Beurel, S. F. Grieco, y R. S. Jope, «Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): regulation, actions, and diseases», Pharmacol Ther, vol. 0, p. 114, 2015, doi: 10.1016/J.PHARMTHERA.2014.11.016.[108] M. Julien, C. Bouguechtouli, A. Alik, R. Ghouil, S. Zinn-Justin, y F. X. Theillet, «Multiple Site-Specific Phosphorylation of IDPs Monitored by NMR», Methods in Molecular Biology, vol. 2141, n.o 26, pp. 793--817, 2020, doi: 10.1007/978-1-0716- 0524-0_41.[109] H. Nishi, A. Shaytan, y A. R. Panchenko, «Physicochemical mechanisms of protein regulation by phosphorylation», Front Genet, vol. 5, n.o AUG, p. 270, ago. 2014, doi: 10.3389/FGENE.2014.00270/BIBTEX.[110] B. M. Chacko, B. Qin, J. J. Correia, S. S. Lam, M. P. de Caestecker, y K. Lin, «The L3 loop and C-terminal phosphorylation jointly define Smad protein trimerization», Nat Struct Biol, vol. 8, n.o 3, pp. 248-253, 2001, doi: 10.1038/84995.[111] J. M. Brazill, C. Li, Y. Zhu, y R. G. Zhai, «NMNAT: It’s an NAD+ Synthase… It’s a Chaperone… It’s a Neuroprotector», Curr Opin Genet Dev, vol. 44, p. 156, jun. 2017, doi: 10.1016/J.GDE.2017.03.014.ESTUDIO DEL METABOLISMO DEL NAD EN PARASITOS PROTOZOOS: CONSOLIDANDO RESULTADOS EN BUSCA DE APLICACIONESImplementación de líneas celulares fluorescentes de Escherichia coli y Leishmania braziliensis para el desarrollo de un bioensayo de citotoxicidad in vitroInnovando metodologías: desarrollo de un sistema de infección in vitro de macrófagos murinos con parásitos fluorescentes de Leishmania braziliensisDivisión de Investigación Sede Bogotá (DIB), Universidad Nacional de ColombiaEstudiantesInvestigadoresORIGINAL13278347.2023.pdf13278347.2023.pdfTesis de Maestría en Ciencias - Bioquímicaapplication/pdf3325355https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/84301/2/13278347.2023.pdfaa52bac148300794ea967e3d1b4f8c17MD52LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; 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Colombiarepositorio_nal@unal.edu.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