Purificación y caracterización parcial de mucina citoplasmática utilizando la lectina de Salvia bogotensis

Las mucinas son un grupo de glicoproteínas altamente O-glicosiladas, utilizadas como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades como fibrosis quística y cáncer. Para identificarlas se han utilizado Lectinas, capaces de reconocer específicamente glicoconjugados. El objetivo del presente trabajo fue purificar parcialmente proteínas citoplasmáticas ricas en antígeno Tn de las líneas celulares MCF-7 y HeLa empleando la lectina de Salvia bogotensis (LSBo). Para realizar el aislamiento de la mucina se usó cromatografía de afinidad sobre Sepharosa 4B, el acople de la lectina sobre el soporte se realizó siguiendo el protocolo de Hermanson. Se sembraron extractos citoplasmáticos derivados de las líneas celulares, posteriormente se eluyó la fracción retenida con gradiente discontinuo de pH (2,5-11,4). Se obtuvieron tres picos de proteína a los cuales se les realizó electroforesis en SDS. Se observó la presencia de una banda predominante de aproximadamente 65 kDa en todas las fracciones eluidas indicando así la posible presencia de la misma proteína en las fracciones retenidas y también diferentes afinidades hacia la Lectina. Se evaluó mediante western blot el reconocimiento por parte de diferentes anticuerpos policlonales y se encontró que la proteína asilada es de tipo mucina, seguidamente se procedió a evaluar su estructura glicosidica mediante la utilización de algunas lectinas. Para evaluar la pureza de la banda aislada se procedió a realizar electroforesis bidimensional encontrando proteínas con pesos moleculares muy similares pero con puntos isoeléctricos ácidos diferentes. Los resultados muestran la existencia de una proteína citoplasmática con diferentes afinidades hacia LSBo tanto en HeLa como en MCF-7. / Abstract. Mucins are a group of high molecular weight glycoproteins highly O-glycosylated, used as biomarkers for diagnosis of diseases such as cystic fibrosis and cancer. Lectins are proteins that have been used to identify specific glycoconjugates. The aim of this work was to purify partially a cytoplasmic protein rich in Tn antigen from cell lines MCF-7 and HeLa using affinity chromatography with Salvia bogotensis lectin (SBoL). To isolate the mucin we used affinity chromatography on SBoL-Sepharose 4B. Cytoplasmic extracts from HeLa cand MCF-7 cell lines were eluted with discontinuous gradient of pH (2.5 to 11.4). We obtained three peaks in retained fraction and were evaluated with SDS-PAGE. The results showed the presence of a predominant band of appromimately 65 kDA in retained fraction, indicating the possible presence of the same protein in them and different affinities toward the lectin. The protein was tested by Western blot using different polyclonal antibodies and we found that protein is mucin-like. After that we tested its glycosidic structure using some lectins. To assess the purity of the isolated band was performed with bidimensional electrophoresis and found some spots with a very similar molecular weight but different isoelectric points. The results showed the existence of a cytoplasmic protein in HeLa and MCF-7 cell lines with different affinities to LSBo.

• Autores: Torres Romero, José Camilo
• Fecha de publicación: 2010
• Institución: Universidad Nacional de Colombia
• Repositorio: Universidad Nacional de Colombia
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unal.edu.co:unal/6868
• Acceso en línea: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/6868; http://bdigital.unal.edu.co/3104/
• Palabra clave: 54 Química y ciencias afines / Chemistry; 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology; Biomarcador; Mucina; Antígeno Tn; Lectina; Biomarker; Mucins; Tn antigen; Lectins
• Rights: openAccess
• License: Atribución-NoComercial 4.0 Internacional