Optimización del proceso de producción, purificación y caracterización de una lacasa a partir de un hongo nativo con potencial aplicación en procesos biotecnológicos

La producción de enzimas lignolíticas es una propiedad que exhiben algunos organismos como los hongos. Entre ellas las lacasas se destacan como enzimas oxidasas de cobre (E.C. 1.10.3.2) que catalizan la oxidación por un electrón de compuestos fenólicos, aminas aromáticas, y otros sustratos ricos en electrones con la concomitante reducción de O2 a H2O, con una amplia inespecificidad de sustrato que las hace llamativas para diferentes aplicaciones industriales. Este trabajo buscó potenciar la producción de una lacasa seleccionada entre 7 hongos productores evaluados, con miras a su purificación y caracterización. La cepa seleccionada fue el organismo Xylaria sp. (CH003) el cual fue encontrado sobre madera en descomposición en el Parque Natural Chicaque ubicado entre los municipios de Soacha y San Antonio, Cundinamarca, Colombia. La actividad lacasa fue valorada utilizando azino-bis(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato (ABTS) en cultivos del hongo llevados a cabo en fermentación sumergida, encontrando una alta actividad (1021±114 U/L). El medio de cultivo fue optimizado mediante el método de un factor a la vez para fuentes de carbono y nitrógeno, un arreglo ortogonal de Taguchi, y el uso de inductores. Los resultados mostraron que el salvado de trigo (50g/L), KNO3 (1,4g/L) y el inductor 2,5-xilidina (1mM) son componentes importantes del medio de cultivo para elevar la actividad enzimática a un valor de 20535±1405 U/L. Una vez optimizado el medio para la producción de lacasas, la enzima fue purificada mediante diafiltración, cromatografía de intercambio aniónico DEAE, y de exclusión por tamaño. Se obtuvo un factor de purificación de 7,45 y un rendimiento de 0,51% y una vez purificada presentó una actividad específica de 388 U/mg. De acuerdo al análisis electroforético 2D se sugiere la presencia de una proteína de ~38KDa, con un pI de 4,9. Por espectrometría de masas se detectó la presencia de los péptidos GPASAPYDEDK y LVNTAIDTMFK que han sido reportados para lacasas. La enzima purificada presentó un rango de pH y temperatura óptima de reacción entre 3-4 y 50-60°C, respectivamente. Sin embargo, se observó una mayor estabilidad a 30 °C durante tres horas de incubación, manteniendo el 97,2% de actividad, y también una alta estabilidad a valores de pH de 6,7 y 8 reteniendo más del 80% de la actividad luego de tres horas. Usando ABTS se determinó una Km de 297μM y una Vmax de 581,4 μM/min a un pH y temperatura de reacción de 4,5 y 22°C. La enzima fue inhibida por el ion Fe2+, pero inducida por el ion Cu2+. Adicionalmente la enzima no fue altamente inhibida por EDTA (1 y 10mM) en donde conservó casi el 80% de su actividad, pero sí fuertemente inhibida por azida de sodio (1 y 10mM), DTT (0,1mM) y KCN (5mM), en donde la actividad se redujo a menos del 5%.

• Autores: Castaño Urueña, Jesus David
• Fecha de publicación: 2014
• Institución: Universidad Nacional de Colombia
• Repositorio: Universidad Nacional de Colombia
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unal.edu.co:unal/51274
• Acceso en línea: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/51274; http://bdigital.unal.edu.co/45348/
• Palabra clave: 54 Química y ciencias afines / Chemistry; 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology; Oxidasa de cobre; Xylaria sp; Fuentes de carbono y nitrógeno; Diseño ortogonal; Inductor; Cromatografía; Constantes cinéticas; Multicopper oxidase; Xylaria sp; Carbon and nitrogen sources; Orthogonal design; Inducer; Chromatography; Kinetic constans
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