Análisis de retención de intrones y de la expresión de isoformas de p53 en fibroblastos de pacientes con Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch

ilustraciones, fotografías

Autores:
Gaete Carrillo, Paula Valentina
Tipo de recurso:
Fecha de publicación:
2022
Institución:
Universidad Nacional de Colombia
Repositorio:
Universidad Nacional de Colombia
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repositorio.unal.edu.co:unal/84109
Acceso en línea:
https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/84109
https://repositorio.unal.edu.co/
Palabra clave:
610 - Medicina y salud
Síndrome de Beckwith-Wiedemann
Beckwith-Wiedemann Syndrome
Deoxyribonucleic acid DNA
Genetic code
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Código genético
síndromes progeroides
Envejecimiento
Empalme
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p53
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Metodología: Se realizó un cultivo primario de fibroblastos de dos pacientes con Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch (SWR) y de un control sano. Se extrajo el ARN de los fibroblastos por medio de TRIzol. A partir del ARN extraído se midió la expresión de 6 isoformas de p53, del ARN corto nuclear U6 y de genes relacionados con la senescencia celular por medio de RT-PCR. Adicionalmente se realizó un secuenciamiento global de ARN mensajero (RNA-Seq) y se analizó la retención de intrones utilizando el programa IRFinder. Resultados y conclusiones: En el análisis de retención de intrones no se encontraron diferencias marcadas en el porcentaje de retención de intrones (control: 7.8%, WRS1: 6.3% y WRS2: 8.14%). Los genes con mayor retención de intrones están relacionados principalmente con vías relacionadas con la unión al ARN, la regulación del ciclo celular, regulación positiva de la transcripción, regulación positiva de vías relacionadas con la inflamación, regulación negativa de la apoptosis, transcripción del ARN, mitocondria y regulación del inicio de la traducción. Los genes con mayor retención de intrones en los pacientes se relacionan con la respuesta inmune y la función mitocondrial, mientras que los que retuvieron más intrones en el control se relacionan con la respuesta al estrés oxidativo. La paciente WRS1 mostró una mayor expresión de ARN corto nuclear U6 comparada con el control y con la paciente WRS2. Los fibroblastos de las pacientes con SWR expresaron un mayor porcentaje de p53 y un menor porcentaje de 133p53 concordante con una mayor expresión de los marcadores de senescencia celular p16 y p21. Estos resultados resaltan la importancia de la función de la ARN polimerasa III en el mantenimiento de la homeostasis celular, principalmente en los procesos de empalme y de reparación del ADN. (Texto tomado de la fuente)Aim: The aim of this study was to evaluate the impact of pathogenic variants in RNA Polymerase III subunit A (POLR3A) on intron retention and on the relative expression of the short nuclear RNA U6 and of different p53 isoforms in fibroblasts derived from patients with Wiedemann-Rautenstrauch Syndrome (WRS). Methods: Primary culture of fibroblasts from two patients with Wiedemann-Rautenstrauch Syndrome (WWS) and a healthy control was performed. RNA was extracted from fibroblasts using TRIzol. The expression of six p53 isoforms, the short nuclear RNA U6 and genes related to cell senescence were measured by RT-PCR. Additionally, global mRNA sequencing (RNA-Seq) was performed, and intron retention was analyzed using IRFinder. Results and conclusions: In the intron retention analysis, no significant differences were found in the percentage of intron retention (control: 7.8%, WRS1: 6.3% and WRS2: 8.14%). The genes with more intron retention are mainly related to pathways related to RNA binding, cell cycle regulation, positive regulation of transcription, positive regulation of pathways related to inflammation, negative regulation of apoptosis, RNA transcription, mitochondria, and regulation of translation initiation. The genes with more intron retention in WRS patients are related to the immune response and mitochondrial function, while those with more retained introns in the control are related to the response to oxidative stress. Patient WRS1 showed a higher expression of short nuclear RNA U6 compared to control and patient WRS2. Fibroblasts from patients with WRS express a higher percentage of p53 and a lower percentage of 133p53, consistent with a higher expression of the cellular senescence markers p16 and p21. These results highlight the importance of an adequate function of RNA polymerase III in the maintenance of cellular homeostasis, mainly in the splicing and DNA repair processes.MaestríaMagíster en Genética Humana4.1 Tipo de estudio Estudio experimental llevado a cabo en fibroblastos obtenidos de dos pacientes con Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch y un control sano. 4.2 Descripción de las pacientes La paciente WRS1 es una paciente de sexo femenino de 21 años de edad, natural y procedente de Bogotá, con fenotipo concordante con el Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch y con hallazgo de una variante patogénica heredada de la madre en el gen POLR3A (c. 3772_2773delCT; p.Leu1258Glyfs*12). Esta variante está clasificada como una variante patogénica debido a que cumple con los criterios de patogenicidad de las guías del Colegio Americano de Genética Médica (ACMG): PVS1, PP5 y PM2, y no cumple con ningún criterio de benignidad. La paciente WRS2 es una paciente de sexo femenino de 6 años de edad, natural y procedente de Bogotá, con fenotipo concordante con el Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch y con hallazgo de una variante patogénica heredada del padre en el gen POLR3A (c.3G>T; p.Met1Leu*). Esta variante está clasificada como una variante patogénica debido a que cumple con los criterios de patogenicidad de las guías del ACMG: PVS1, PP5 y PM2, y no cumple con ningún criterio de benignidad. El control es una persona sana de sexo femenino de 21 años de edad. 4.3 Obtención de fibroblastos Previo consentimiento informado se tomó una biopsia de piel de la parte interna del brazo de dos pacientes femeninas con Síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch en la primera y en la tercera década de la vida y de un control sano. Para obtener la muestra se desinfectó el área con alcohol al 70% y se extrajó un fragmento de piel de la zona deseada usando el punch y las pinzas de disección, luego se suturó la herida con un punto. Posteriormente, la muestra recogida fue colocada en un tubo falcon de 15 mL con 12 mL de medio suplementado previamente atemperado a 37°C. Después, en la cabina de flujo, se retiró el medio en el cual se encontraba la biopsia y se realizaron tres lavados con PBS 1X al 1% de penicilina/estreptomicina estéril con movimientos rotatorios y se descartó el sobrenadante. Luego, en una caja de Petri de 100 mm se añadieron 3 mL de PBS 1X, 3 mL de medio suplementado y el fragmento de piel. Una vez sumergida, la muestra se fragmentó en 12 a 18 trozos con una hoja de bisturí anclado a un mango adecuado. Una vez ya obtenidos los fragmentos, se retiró cuidadosamente el medio circundante y se agregaron 3 mL de tripsina-EDTA al 0.25% y se dejó incubando durante 5 minutos a 37°C. Posteriormente, se inactivó la tripsina con 10 mL de medio suplementado en un tubo falcon de 15 mL. Se centrifugó el contenido del tubo a 1000 rpm durante tres minutos, se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 8 mL de medio suplementado fresco. El contenido del tubo falcon fue dividido en dos partes iguales y transferido a dos frascos T25 que se dejaron incubando a 37°C y 5% de CO2. Se cambió el medio cada 24 horas aproximadamente. Los fibroblastos alcanzaron un porcentaje de confluencia cercano al 70% a los 25-30 días. 4.4 Extracción de ARN Alrededor de 30 días después de la obtención de la biopsia, una vez las células alcanzaron un porcentaje alto de confluencia, se extrajo el ARN con TRIzol para los análisis posteriores. Las células fueron lisadas usando el reactivo TRIzol durante 5-10 minutos, con el objetivo de permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína. Después se pasó el lisado celular a un eppendorf de 1.5 mL, se centrifugó a 14mil rpm durante diez minutos y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Luego se agregaron 200 µL de cloroformo por cada mL de reactivo TRIzol y se agitó vigorosamente a mano durante 15 segundos. Posteriormente, se dejó incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugó a 12mil gravedades durante 15 minutos a 4 grados Celsius. Después de la centrifugación, la fase acuosa, que contiene el ARN se transfirió a un tubo nuevo y el ARN se precipitó agregando 500 µL de alcohol isopropílico. Las muestras se dejaron incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugaron a 12 mil gravedades durante 10 minutos a 4 grados Celsius. Después se removió el sobrenadante y se lavó el pellet de ARN con 1 mL de etanol al 75% en agua DEPC mezclando con vórtex. Luego, se centrifugó a 7500 gravedades durante 8 minutos a 4 grados Celsius, se removió el sobrenadante y se secó el ARN durante 5 minutos. Una vez seco, el ARN fue disuelto en 50 µL de agua DEPC. Las muestras fueron cuantificadas usando NanoDrop. Este proceso se realizó por triplicado. 4.5 Análisis de expresión global de ARN (RNA-Seq) El ARN extraído fue llevado a secuenciación de nueva generación de ARNs con secuencia de poliA utilizando un equipo Illumina. Los datos del RNA-Seq fueron entregados en formato FASTA y con las secuencias de adaptadores eliminadas. Las secuencias fueron alineadas usando STAR aligner v27.0a, utilizando como genoma de referencia y como genoma de anotación la secuencia del genoma humano GRCh38. Una vez concluido el proceso de alineación, se obtuvieron los archivos BAM unsorted, luego estos archivos fueron subidos al programa IRFinder, en dónde se obtuvieron los resultados de la medición retención de intrones global en archivos de texto, como la proporción de retención de intrones, que es igual a la abundancia de intrones sobre la abundancia de intrones más exones (Middleton, et al., 2017). Luego se realizó el análisis diferencial de la retención de intrones en DESeq2 en una interfaz R, siguiendo las instrucciones del manual de IRFinder. Después se analizaron las vías metabólicas en las que participan los genes con una retención de intrones diferencial utilizando las bases de datos de ontología genética y KEGG (Zheng, et al., 2020), utilizando DAVID. 4.6 Medición de la expresión relativa del ARN corto nuclear U6, de las diferentes isoformas de p53 y de otros genes relacionados con el empalme o la senescencia celular El ARN extraído y previamente cuantificado fue utilizado para realizar síntesis de ADN complementario mediante un proceso de transcripción reversa utilizando el kit Superscript III de Invitrogen. Se agregó el volumen equivalente a 5 µg de ARN en un tubo de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) libre de ARNasas y luego se añadieron los otros componentes de la mezcla para alcanzar una concentración final de 10 M de primers de hexámeros al azar, 0.5 mM de deoxinucleotidos trifosfato (dNTPs), 1X de buffer, 0.5 UI de transcriptasa reversa, 40 UI de RNase OUT y se completó el volumen con agua DEPC hasta alcanzar 10 µL. La mezcla se dejó incubando a temperatura ambiente durante 5 minutos. En el termociclador se inició con un periodo de 2 minutos a 94 grados Celsius, con el objetivo de alcanzar la denaturación completa del ARN y después se realizaron 40 ciclos de denaturación (94 grados Celsius durante 45 segundos), anillaje (60 grados Celsius durante 30 segundos) y extensión (72 grados Celsius durante 40 segundos), finalmente se dejó incubando la muestra a 4 grados Celsius. El ADN complementario obtenido fue cuantificado usando NanoDrop. Una vez obtenido el ADN complementario se midió la expresión relativa de las isoformas de p53, de U2AF1, p16, p21, GSTM1 y del ARN corto nuclear U6 usando los primers nombrados en la tabla 2. Para la cuantificación de la expresión de GSTM1, p16, p21 y U2AF1 se usó como gen control el de la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH), en el caso del ARN corto nuclear U6, se usó el gen de ARN corto nuclear U48 (RNU48) y en el caso de las isoformas de p53 se utilizó como gen de referencia el de la beta-actina. Tabla 2 Primers utilizados para medir la expresión relativa del ARN corto nuclear U6, de las diferentes isoformas de p53 y de genes relacionados con el empalme y la senescencia celular. ARN corto nuclear U6 Primer Forward 5’-CAGCACATATACTAAAATTGGAACG-3’ Primer Reverse 5’-ACGAATTTGCGTGTCATCC-3’ Gen control: ARN corto nuclear U48 Primer Forward 5′-TGATGATGACCCCAGGTAACTC-3′ Primer Reverse 5′-GAGCGCTGCGGTGATG-3 Isoformas de p53 Primer Forward (e2.1-exón 2) 5’ -GTCACTGCCATGGAGGAGCCGCA-3’ Primer Forward (e2-exón 2) 5’- ATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT-3’ Primer Forward (i4FI-intrón 4) 5’- TAGACGCCAACTCTCTCTAG -3’ Primer Forward (i4F2–intrón 4) 5’- CTAGTGGGTTGCAGGAGGTGCTTACAC-3’ Primer Reverse (RT1-exón 11) 5’- GACGCACACCTATTGCAAGCAAGGGTTC -3’ Primer Reverse (RT2-exón 11) 5’- ATGTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTC -3’ Primer Reverse (p53b-exón 9b) 5’- TTTGAAAGCTGGTCTGGTCCTGA-3’ Primer Reverse (p53g-exón 9g) 5’- TCGTAAGTCAAGTAGCATCTGAAGG-3’ Gen control: actina Primer Forward 5’-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’ Primer Reverse 5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’ Glutatión-S-Transferasa 1 (GSTM1) Primer Forward 5’- TACTCTGAGCCCTGCTCGGT-3 Primer Reverse 5’- TGTATTCCAGGAGCAGGCGG-3’ p16 Primer Forward 5'-CCAACGCACCGAATAGTTACG-3' Primer Reverse 5'-GCGCTGCCCATCATCATG-3' p21 Primer Forward 5'-TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3' Primer Reverse 5'-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3' U2AF1 (Factor auxiliar del ARN corto nuclear U2 tipo 1) Primer Forward 5’- CCAGTCTGCTGACGGTTTG-3 Primer Reverse 5’- AGGTGGTCTCCCAGGTTGT-3 Gen control: gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) Primer Forward 5’- TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3´ Primer Reverse 5’-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3´ Para medir la expresión relativa del ARN corto nuclear U6, de GSTM1, de U2AF1, de p16 y de p21, se realizó una PCR en tiempo real en el CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (BioRad) midiendo la fluorescencia utilizando SYBR-Green y realizando 48 ciclos de denaturación, anilaje y extensión. El análisis de los resultados se realizó siguiendo el método Ct. Para medir la expresión relativa de las isoformas de p53 se realizó una PCR anidada utilizando el ADN complementario obtenido y realizando las reacciones establecidas en la Tabla 3. El análisis de los resultados se realizó siguiendo el método Ct. Tabla 3 Primers específicos utilizados en cada reacción de PCR anidada para medir la expresión relativa de 6 isoformas de p53. Adaptado de: Khoury, M. P., Marcel, V., Fernandes, K., Diot, A., Lane, D. P., & Bourdon, J. C. (2013). Detecting and quantifying p53 isoforms at mRNA level in cell lines and tissues. In p53 Protocols (pp. 1-14). Humana Press, Totowa, NJ. 4.7 Verificación del análisis de retención de intrones Para la verificación del análisis de retención de intrones se realizó una electroforesis en un gel de agarosa al 2% de los productos de PCR utilizando los primers descritos en la Tabla 4. Tabla 4 Primers utilizados para la verificación del análisis de retención de intrones PILRB (Receptor beta tipo 2 tipo inmunoglobulina emparejado) Primer Forward 5-‘ ATCCCCTGTTAGAGACGGGC-3’ Primer Reverse 5’- GAACTCAGGCATAGGGGAGC-3’ K7EP35 (NADH Deshidrogenasa 1 Alfa Subunidad 11) Primer Forward 5’-CCTGTCTGCTGTGATTCAGG-3’ Primer Reverse 5’-GGAGGTTGCAGTGAGCTGAG-3’ Glutatión-S-Transferasa 1 (GSTM1) Primer Forward 5’-TTAGGCCTGTCTGCGGAATC-3’ Primer Reverse 5’-GAGATGGAGGGTCCCTGACT-3’ OAS1 (2'-5'-oligoadenilato sintetasa 1) Primer Forward 5’-CCTCCAGCTGCAACCATG-3’ Primer Reverse 5’-GTCTGCTTCCTAGCCATCTG-3’Síndromes progeroidesxvii, 52 páginasapplication/pdfspaUniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Medicina - Maestría en Genética HumanaFacultad de MedicinaBogotá,ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá610 - Medicina y saludSíndrome de Beckwith-WiedemannBeckwith-Wiedemann SyndromeDeoxyribonucleic acid DNAGenetic codeADNCódigo genéticosíndromes progeroidesEnvejecimientoEmpalmeIntronesp53Análisis de retención de intrones y de la expresión de isoformas de p53 en fibroblastos de pacientes con Síndrome de Wiedemann-RautenstrauchIntron retention analysis and differential expression analysis of p53 isoforms in fibroblasts from patients with Wiedemann-Rautenstrauch SyndromeTrabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TMAbascal-Palacios, G., Ramsay, E. 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