Determinación de características funcionales de CtpF, una Ca2+ ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis (TB), una enfermedad infecciosa que causó 1,3 millones de muertes en el año 2017 (de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, WHO), de las que 0,3 millones correspondieron a pacientes coinfectados con VIH. Diversos compuestos quimioterapéuticos y la vacuna BCG son utilizados para el tratamiento de esta enfermedad, pero el surgimiento de cepas multirresistentes y extra-resistentes a los medicamentos además de la eficacia variable de la vacuna han dificultado su control, haciendo a la TB una de las 9 causas de muerte más frecuentes a nivel mundial. La respuesta del sistema inmune a la infección con Mtb comprende su confinamiento en macrófagos al interior de los que el bacilo es sometido a distintas condiciones de estrés como el aumento en la concentración de iones metálicos, reducción de la tensión de oxígeno y la presencia de especies reactivas de nitrógeno y oxígeno. De manera interesante, el comportamiento transcripcional de los 12 genes de ATPasas tipo P codificados en el genoma de Mtb se ve afectado por una o varias de estas condiciones. CtpF, el homologo micobacteriano de la SERCA Ca2+-ATPasa de eucariotas superiores, es la ATPasa que responde a un mayor número de condiciones de estrés, especialmente condiciones de hipoxia; además ctpF es uno de los genes regulados por DosR, regulador global en la adaptación del bacilo tuberculoso al ambiente anaeróbico del macrófago y la entrada al estado de latencia. A través de análisis bioinformáticos y estudios in vitro se ha logrado asociar la actividad ATPasa de CtpF con el transporte de calcio. La evidencia muestra que la hidrólisis de ATP es estimulada por el Ca2+ y, de manera indirecta, se ha observado que contribuye a la tolerar la intoxicación con el metal. No obstante, hasta el momento no ha sido posible verificar la especificidad iónica de CtpF, dado que los experimentos también permiten postular a Na+ y a K+, además de Ca2+, como posibles cationes transportados. En este sentido, el objetivo de este trabajo fue comprobar la especificidad iónica de CtpF, a través del estudio de la acumulación de calcio en células completas y vesículas de membrana de M. smegmatis expresando CtpF de M. tuberculosis de forma heteróloga. Como vector de expresión se utilizó pMV261, un vector lanzadera de micobacterias basado en el promotor de choque térmico de Mycobacterium bovis Hsp60. También se analizó el comportamiento de la ATPasa Pma1, homólogo de CtpF en Mycobacterium smegmatis, con el fin de comparar su respuesta en los ensayos de acumulación y así inferir si sus funciones son equivalentes. Los resultados muestran que las células de M. smegmatis wt y de un mutante defectivo en el gen pma1, transformadas con recombinantes de CtpF y Pma1, acumulan menos calcio que las cepas silvestres o mutante transformadas con el vector pMV261, sugiriendo que las ATPasas están involucradas en el eflujo de este ion desde la cara citoplasmática de la membrana. La intoxicación con Na+ y Na+/K+ de estas células no muestra una acumulación significativa de estos iones en las cepas recombinantes, lo que da soporte a este hallazgo. La acumulación en vesículas de membrana confirmó la dirección del transporte, toda vez que esta ha sido mayor en las vesículas sobre expresando el transportador. Durante la preparación de las vesículas se favorece una configuración inside-out que expone los dominios citoplasmáticos al exterior de estas. Esta evidencia experimental corrobora que CtpF es una ATPasa calcio-dependiente que está involucrada en la homeostasis de calcio al transportarlo desde el interior hacia el exterior celular.

• Autores: Rosales-Hernández, Cristian
• Fecha de publicación: 2019
• Institución: Universidad Nacional de Colombia
• Repositorio: Universidad Nacional de Colombia
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unal.edu.co:unal/76344
• Acceso en línea: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/76344; http://bdigital.unal.edu.co/72633/
• Palabra clave: Mycobacterium tuberculosis; ATPasas tipo P2A; CtpF; Absorción atómica; Acumulación; P2A ATPases, CtpF; Atomic Absorption; Accumulation
• Rights: openAccess
• License: Atribución-NoComercial 4.0 Internacional