Capacidad de hongos para remover fármacos presentes en aguas para riego en la sabana occidental de Bogotá (Colombia)

ilustraciones, fotografías, graficas

Autores:
Vargas Mesa, Iván Camilo
Tipo de recurso:
Fecha de publicación:
2022
Institución:
Universidad Nacional de Colombia
Repositorio:
Universidad Nacional de Colombia
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repositorio.unal.edu.co:unal/82659
Acceso en línea:
https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/82659
https://repositorio.unal.edu.co/
Palabra clave:
570 - Biología
570 - Biología::577 - Ecología
570 - Biología::579 - Historia natural microorganismos, hongos, algas
Biorremediación
antibióticos
Coliforme
Cepa fúngica
Bioremediation
Drug
Coliform
Fungal isolation
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openAccess
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Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional
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En su contenido se encuentran diversos fármacos (claritromicina, carbamazepina, clindamicina, gembifrizol, ibuprofeno, lidocaína, lincomicina, losartan, benzolecgonina, etc) y productos de aseo personal, y además contiene coliformes en concentraciones mayores a las permitidas por la legislación colombiana (decreto 1594 de 1984), lo que ocasiona que los cultivos irrigados por el distrito presenten riesgo biológico para la salud humana. Dentro de los tratamientos biológicos, los hongos son una alternativa para la remediación de aguas gracias a la variedad e inespecificidad de sus enzimas, por lo cual, el objetivo de este trabajo fue evaluar si el tratamiento fúngico es efectivo para mejorar los parámetros de calidad de agua de riego en el distrito de riego de la Ramada. Se aislaron en agar papa dextroxa (PDA) e identificaron a nivel de género veinte cepas fúngicas a partir del agua del distrito de riego de la Ramada, los cuales fueron evaluados individualmente para detectar su capacidad de remoción de fármacos (clindamicina y claritromicina) en un medio líquido utilizando una cepa de Trametes versicolor como control positivo, señalando que éstos fármacos se han reportado previamente en el agua del distrito de riego de la Ramada; obteniendo el mejor desempeño con Sporothrix sp. y T. versicolor. Como prueba adicional, se evaluó su capacidad en medio líquido para inhibir coliformes totales y Escherichia coli, encontrando que para la inhibición de coliformes se destacó el género Sporothrix sp. (aislamiento 7) y Penicillium sp. (aislamiento 13) y en la inhibición de E. coli se destacaron principalmente los géneros Penicillium sp. (aislamientos 5, 8, 10, 12, 13 y 16), Trichoderma sp. (aislamientos 14 y 15) y Absidia sp. (aislamiento 9). Se concluye que se obtuvieron cepas fúngicas con actividad de remoción de fármacos (clindamicina y claritromicina), así como para la inhibición de coliformes totales y Escherichia coli. Se recomienda realizar estudios complementarios para profundizar en el conocimiento de los procesos y en la aplicación de los hongos como agentes biorremediarores de aguas y en particular para mejorar la calidad del agua del distrito de riego de la Ramada (Texto tomado de la fuente).The Ramada Irrigation District is located in the Sabana de Bogotá (Colombia), it captures water from the upper basin of the Bogotá River, and due to urbanization in neighboring sectors, wastewater is generated that reaches the irrigation channels of the district without any treatment. Its content contains various drugs (clarithromycin, carbamazepine, clindamycin, gembifrizol, ibuprofen, lidocaine, lincomycin, losartan, benzolecgonine, etc.) and personal hygiene products, in addition to containing coliforms in concentrations higher than those permitted by Colombian law (decree 1594 of 1984), which causes the crops irrigated by the district to present a biological risk to human health. Within the biological treatments, fungi are an alternative for water remediation due to the variety and non-specificity of their enzymes, therefore, the objective of this work was to evaluate if the fungal treatment is effective in improving water quality parameters. Irrigation water in the Ramada irrigation district. Twenty fungal strains were isolated in potato dextroxa agar (PDA) and identified at the genus level from the water of the irrigation district of La Ramada, which were individually evaluated to detect their ability to remove drugs (clindamycin and clarithromycin) in a liquid medium using a strain of Trametes versicolor as a positive control, noting that these drugs have been previously reported in the water of the Ramada irrigation district; obtaining the best performance with Sporothrix sp. and T. versicolor. As an additional test, its capacity in liquid medium to inhibit total coliforms and Escherichia coli was evaluated, finding that the genus Sporothrix sp. isolate 7) and Penicillium sp. (isolation 13) and in the inhibition of E. coli the genera Penicillium sp. (isolates 5, 8, 10, 12, 13 and 16), Trichoderma sp. (Isolates 14 and 15) and Absidia sp. (Isolation 9). It is concluded that fungal strains with drug removal activity (clindamycin and clarithromycin) were obtained, as well as for the inhibition of total coliforms and Escherichia coli. It is recommended to carry out complementary studies to deepen the knowledge of the processes and the application of fungi as water bioremediation agents and in particular to improve the water quality of the Ramada irrigation district.MaestríaMagíster en Ciencias - BiologíaÁrea de estudio El distrito de riego de la Ramada se ubica en el costado occidental de la Sabana de Bogotá, Colombia (Bustos, 2018), limita por el occidente con el río Subachoque, al norte con la vía la Mesa, Funza y las ciénagas Gualí y tres esquinas, al oriente y el sur con el Río Bogotá, como se observa en la figura 2-3. Al tomar agua de las desembocaduras de ríos con vertimientos, el agua suele tener elementos nocivos, que no se tratan ni se disuelven de manera natural a lo largo de su recorrido. La contaminación que circula en los canales y estaciones de la Ramada es de preocupación para las autoridades ambientales (Ramírez, 2021), desde el inicio del recorrido, en la estación de bombeo Chicú donde toma agua directamente del río Bogotá (Alcázar et al, 2020), es notable la contaminación y la formación de espuma sobre el agua. 4.2 Aislamiento de cepas fúngicas La técnica de realizar diluciones sucesivas de la muestra y su posterior siembra en placa en un medio de cultivo apropiado, permite el crecimiento de microorganismos cultivables presentes en la muestra (Sanz, 2011). Con el objeto de aislar cepas fúngicas presentes en el agua de riego del distrito de riego de la Ramada se efectuó: - Muestreo en 6 puntos (cada muestra equivalente a 1 litro), tomadas en temporada seca y en temporada invernal. Las muestras puntuales se tomaron siguiendo el protocolo del laboratorio de ingeniería ambiental de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá (LIA- PT- 002), cada muestra se almacenó en botellas plásticas de dos litros (Sánchez, 2020). - En el laboratorio se procesó una muestra integrada con 2 mL de cada muestra tomada, y en total se obtuvieron 12 mL de muestra integrada (Delgadillo et al., 2010; Clescerl et al., 1999; Luby et al., 2015), como se observa en la figura 2-4: Figura 2-4: Muestra integrada conformada a partir de un volumen igual proveniente de cada uno de los puntos de muestreo. - Se obtuvieron dos muestras integradas, una de la temporada invernal y otra de la temporada seca. - A 10 mL de la muestra integrada se le agregaron 90 mL de solución salina (0,9% cloruro de sodio) para completar la primera dilución (10−1). - A partir de la primera dilución se tomó 1 mL y se agregó a un tubo de ensayo con 9 mL de solución salina (dilución 10−2), y se continuó con la serie de diluciones hasta la dilución 10−7 utilizando solución salina 0,9% (Prats, 2005). - Se realizó siembra en superficie (agar papa dextrosa – PDA - y agar extracto de malta) a partir de las diluciones (10-1 a 10-7), usando 0,1mL por cada siembra (Mier et al., 2002) por quintuplicado (Madigan et al., 2015). A los medios se le adicionó cloranfenicol para disminuir la incidencia de bacterias que compiten por sustratos con los hongos (Moreira et al., 2012). - Se ha reportado (Mier et al., 2002) la obtención del cultivo fúngico de 3 a 7 días a 28°C, pero teniendo en cuenta que la temperatura media de zonas aledañas al distrito de riego de la Ramada es de 14°C (Medellín & Algecira, 2018), se mantuvo el cultivo a temperatura ambiente. - Se obtuvieron colonias que fueron purificadas en sucesivos repiques (Mier et al., 2002). - Para diferenciar los aislamientos realizados entre hongos, levaduras y bacterias se realizó tinción de Gram, teniendo presente que si bien ésta tinción es utilizada para observación microscópica de bacterias, permite diferenciar entre hongos levaduriformes y bacterias, señalando que en el presente estudio se trabajó con los asilamientos de hongos filamentosos, descartando los hongos levaduriformes y bacterias. - Se efectuó descripción macroscópica de cada una de las colonias aisladas tanto en el anverso como en el reverso de la caja de Petri con los medios de cultivo. - Se realizó descripción microscópica de cada morfotipo aislado mediante el uso de la técnica de micro cultivo para cada cepa purificada y se efectuaron montajes en lámina-laminilla para observar microscópicamente (40x) de características morfológicas y estructuras reproductivas, empleando claves taxonómicas para identificación a nivel de género (Barnett & Hunter, 1998), efecuando observación de estructuras reproductivas y del tipo de micelio con el uso de azul de lactofenol (García, 1995). Adicionalmente, se efectuó cultivo en otros medios tales como: Sabouraud Maltose Agar (SMA), Czapek-Dox, Sabouraud Dextrose Agar (SDA) (Pérez et al., 2003). - Se realizó recuperación de Trametes versicolor como cepa control a partir del Laboratorio de fisiología de hongos del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá. - Los hongos aislados fueron mantenidos en tubos de vidrio tapa rosca con medio agar papa dextrosa (PDA) en posición inclinada (pico de flauta) y fueron repicados cada 3 meses, con el fin de evitar deshidratación y contaminación (Cañedo & Ames, 2004). 4.3 Preparación de pellets de hongos Para la obtención de pellets fúngicos, se adaptó la metodología propuesta por Blanquéz et al. (2004) que se describe como sigue: 1. A partir del cultivo en medio sólido se tomó 1 cm2 del agar con micelio y se agregó a 150 mL de caldo extracto de malta previamente esterilizado para obtener una suspensión micelial (Blanquéz et al., 2004). 2. La suspensión se mantuvo en cultivo por 4 a 5 días en un shaker orbital (135 rpm, r= 25 mm) (Blanquéz et al., 2004). 3. La suspensión obtenida se homogenizó y se utilizó 1 mL para inocular 250 mL de medio extracto de malta en un erlenmeyer, colocando en agitación en un shaker orbital a 135 rpm, durante 5-6 días. 4. Los pellets obtenidos se centrifugaron a 5000 rpm y se precipitaron el medio de crecimiento se removió y se lavaron con agua estéril (Hailei et al., 2016; Wrede et al., 2014; Cruz-Morató et al., 2014). 5. Los pellets obtenidos se almacenaron en solución salina (0,85 % NaCl) a 4ºC, pudiendo permanecer activos por dos meses sin perder su morfología (Baccar et al., 2011). 4.4 Evaluación de remoción de fármacos La evaluación se determina mediante espectrofotometría, inicialmente se construyó una curva de calibración con los fármacos a utilizar: clindamicina y claritromicina. Se utilizaron los patrones construidos previamente (Yarraguntla et al., 2002, Barazandeh et al., 2013, Nataraj et al., 2013, Naveed & Qamar, 2014), con el fin de determinar los parámetros y la longitud de onda a utilizar: ABS 210 nm; la gráfica se construyó utilizando una concentración conocida en 25 concentraciones diferentes del fármaco contra la absorbancia obtenida, generando una gráfica para cada fármaco. La curva patrón de los dos fármacos se construyó con agua destilada para las disoluciones y la preparación de cada concentración, sin embargo, al utilizar un medio líquido con extracto de levadura en los ensayos posteriores, se construyeron de nuevo ambas gráficas con el medio con extracto de levadura como solvente. Se utilizó clindamicina marca: LaSanté 300 mg y claritromicina marca: Labquifar 500 mg, como la presentación de la claritromicina era en pastillas sólidas, se maceró la pastilla en un mortero que previamente se había esterilizado. Las presentaciones comerciales de cada fármaco son asequibles para un ensayo exploratorio y facilitan evaluar a bajo costo si los aislamientos fúngicos tienen una capacidad para remoción. • El ensayo se realizó utilizando 0,5 gr de pellet de cada uno de los hongos adicionado a caldo malta, el cual contenía 10 g de extracto de malta + 1 g de cloruro de amonio + 14 mL de ácido tartárico 10%, según la metodología reportada por Motury & Charya (2009), con cada cepa fúngica se evaluaron repeticiones por quintuplicado, la incubación se efectuó por 10 días en agitación circular a 135 rpm según Motury & Charya (2009), este intervalo de tiempo fue el que más desempeño tuvo en sus ensayos; para evitar degradación de los fármacos por efecto de la luz solar, cada matraz estuvo cubierto con papel aluminio o vinipel oscuro. Se usó un control negativo para determinar la degradación sin ningún inoculo. Cabe anotar que el ácido tartárico permite disminuir el pH del medio, esto para facilitar el crecimiento de los hongos y disminuir el crecimiento de bacterias. Luego de 10 días de incubación, se filtró la biomasa y el líquido obtenido fué evaluado por espectrofotometría para determinar el grado de remoción del fármaco. Además, a los datos de remoción se trataron mediante un test de ANOVA para determinar el valor de la significancia para reconocer si los tratamientos diferían entre sí lo suficiente como para atribuirlo a la actividad de los ailamientos. La concentración utilizada para la Clindamicina fue de 3g•L-1 y Claritromicina de 0,5 g•L-1. 4.5 Evaluación de la inhibición de coliformes Para evaluación de la concentración de coliformes totales y fecales se realizó un cultivo de la muestra de agua proveniente del distrito de La Ramada sobre el medio Agar CHROMOCULT que permitió evaluar la presencia de E. coli en la muestra, por la formación de coloración azul en las colonias y la coloración roja en otros coliformes (Navarro, 2007), señalando que esté método es utilizado por el IDEAM y por EU-EPA para agua potable y detecta unidades formadoras de colonias (UFC) en un rango de 1 a 200000 UFC/100 mL y según el decreto 1594, el máximo de UFC permitido es de 1000 UFC, por lo que es un método apropiado. Para su evaluación en el presente estudio se efectuó lo siguiente: 1. Con los pellets de los hongos aislados disponibles, se pesaron en tubos de ensayo previamente esterilizados 0,5 gramos de cada uno por tubo de ensayo (cada hongo tuvo quintuplicado). Se usaron 0,5 gr según la metodología de Tao et al. (2021), ya que es el peso de pellets que mejor desempeño tuvo sobre el tratamiento de residuos en inhibición. 2. A cada uno de los tubos con pellets se le agregaron 10 mL de la muestra líquida contaminada con coliformes (totales y fecales). También se realizó un control del agua sin ningún inóculo para hacer el tratamiento paralelo a los pellets y poder evaluar si la disminución bacteriana también se daba sin la presencia de micelio. 3. Para conocer el valor de coliformes totales y fecales iniciales se realizó un control tomando el agua y haciendo una filtración con membrana de 0.45 um y posteriormente, la membrana con sus contaminantes retenidos, se sembró en medio CHROMOCULT que permitió (luego de 24 horas de cultivo en incubadora), determinar cuántas unidades formadoras de colonia (UFC) había en el líquido (Kerh et al., 2013). 4. Luego de 6 días de tratamiento de los tubos con los pellets, se realizó filtración a cada uno con una membrana de 0.45 um, de tal forma que en la membrana quedaron retenidas las bacterias, las cuales luego fueron colocadas sobre el medio CHROMOCULT y se incubaron por 24 horas a 37ºC, para posteriormente realizar un conteo de colonias de coliformes fecales y totales (Kerh et al., 2013). 5. El conteo de microorganismos se realizó mediante la técnica de unidades formadoras de colonia (UFC) y se obtuvo la concentración de coliformes (fecales y totales, según la coloración formada en el cultivo), expresada en unidades formadoras de colonias por 100 mililitros (ufc/ 100 mL) (Carrillo & Lozano, 2008). 6. El tratamiento de datos se realizó con un test de ANOVA para determinar si los tratamientos difieren entre sí lo suficiente como para atribuirlo a la acción de los hongos.xviii, 77 páginasapplication/pdfspaIniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - BiologíaFacultad de CienciasBogotá, ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá570 - Biología570 - Biología::577 - Ecología570 - Biología::579 - Historia natural microorganismos, hongos, algasBiorremediaciónantibióticosColiformeCepa fúngicaBioremediationDrugColiformFungal isolationCapacidad de hongos para remover fármacos presentes en aguas para riego en la sabana occidental de Bogotá (Colombia)Capacity of fungi to remove drugs present in waters for irrigation in the western savannah of Bogotá (Colombia)Trabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TMRedColLaReferenciaA. 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