Desarrollo de un nuevo método para el análisis del estado de metilación del gen hTERT y su asociación con la infección por el virus de papiloma humano en tejidos de pacientes con cáncer cervical invasivo (2013)
El cáncer de cuello uterino es un problema de salud pública en Colombia, con una incidencia de 21.5 X 100000 mujeres al año. Se ha demostrado una fuerte relación entre la infección con el virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo y el desarrollo de cáncer cervical y de sus lesiones precursoras. La presencia de VPH es así, una causa necesaria pero no suficiente para el desarrollo de cáncer cervical y otros factores del virus, del huésped y del ambiente pueden estar involucrados en la oncogénesis cervical. Uno de estos factores es la enzima telomerasa, ésta ha sido asociada con procesos de inmortalización celular y que está compuesta una subunidad catalítica con actividad transcriptasa reversa, codificada por el gen hTERT, y un componente de ARN (TR o TER), que sirve como molde para sintetizar las repeticiones telomericas. Algunos estudios han sugerido que el estado de metilación del gen hTERT está asociado con la desregulación en la expresión de la proteína, además de proponer que en cáncer cervical esta alteración puede ser medida por la patogénesis del virus del papiloma humano. Sin embargo en la actualidad se sabe poco sobre el papel de la metilación del gen hTERT y su asociación con la infección por VPH en la carcinogénesis cervical. La mayoría de los ensayos usados para analizar patrones de metilación son laboriosos, poco informativos y costosos; es por ello que se requiere del desarrollo de técnicas de fácil manejo, óptimas para la obtención de esta información y que permitan analizar eficientemente grandes números de muestras. En este trabajo se desarrollo un nuevo método basado en el ensayo de línea reversa para el análisis de metilación del gen hTERT y se estableció su asociación con la infección por Virus de Papiloma Humano en tejidos de pacientes con cáncer cervical invasivo. 205 muestras de tejidos de pacientes con cáncer cervical invasivo fueron analizadas, 115 de tejidos embebidos en parafina y 90 de tejidos frescos congelados. Para establecer el estado de metilación del gen hTERT se desarrolló y valido la técnica Reverse line blot sensible a metilación la cual permite el análisis de 44 muestras y dos regiones del gen en un solo ensayo (región del promotor y primer exón). La tipificación para infecciones por VPH de alto riesgo (AR) se estableció uutilizando el ensayo PCR-GP5+/GP6+bio-Reverse Line Blot (RLB) que permite la identificación de 14 tipos de VPH-AR. 105 muestras fueron positivas para el análisis de metilación de las cuales 20 (23,2%) hacían parte del grupo de los tejidos embebidos en parafina y 85 (97,7%) de los tejidos frescos congelados. El 67% de las muestras no presento metilación, 32,4% presento metilación parcial y ninguna presento metilación completa. Al realizar el análisis de metilación por regiones se encontró que la región del primer exón presento un porcentaje de metilación más elevado (32,4%) con respecto a la región del promotor (20%), porcentajes similares se encontraron cuando se realizó el análisis por separado de tejidos frescos y tejidos embebidos en parafina. Para la tipificación del VPH 157 muestras dieron positivas de las cuales 140 (89,2%) presentaron infecciones simples y 17 (10,8%) presentaron infecciones múltiples, el VPH tipo 16 (58,6%) fue el más frecuente seguido por el VPH tipo 18 (8,6%). Se realizó el análisis de asociación con 98 muestras que fueron positivas para tipificación y para el estado de metilación del gen hTERT. Se tuvieron en cuenta dos tipos de análisis de asociación uno descriptivo debido a las bajas frecuencias de algunos tipos virales y otro estadístico que comprendió las dos especies de VPH que contienen la mayoría de tipos de AR, las especies alfa 7 y alfa 9. El VPH tipo 16 fue el más frecuente presentándose en el 59,2% de las muestras. Al igual que en el análisis de metilación, la región del primer exón presento un porcentaje de metilación mayor que la del promotor en todas las muestras que fueron positivas para el VPH-AR. Por otra parte al realizar el análisis descriptivo agrupando los tipos de VPH por especie se observó que todos los tipos pertenecientes a la especie alfa 7 presentaron un patrón de 0% de metilación en la región del promotor, contrario a lo observado en las otras especies que siempre presentaron algún porcentaje de metilación en esta misma región. Al realizar el análisis estadístico se estableció que existe una asociación significativa entre el estado no metilado de la región del promotor y las especies de VPH alfa 7 y alfa 9 (p=0,01 y 0,04). Por otra parte al realizar el análisis de asociación para el estado de metilación entre regiones del gen se encontró que existe una asociación estadísticamente significativa (p=0,005), lo que sugiere que el estado de metilación de la región del promotor influye en la metilación del primer exón. El Reverse line blot sensible a Metilación, desarrollado y validado en este trabajo permite la identificación de tres patrones de metilación en dos regiones del gen hTERT y Presenta ventajas con respecto a otras técnicas debido a su alta sensibilidad, especificidad, el costo de implementación, facilidad para su implementación y realización. Se presentó un bajo porcentaje de metilación en las dos regiones del gen analizadas debido a que estas regiones son importantes por contener sitios de unión que favorecen la transcripción y es importante mantener bajo nivel de metilación en este tipo de muestras telomerasa positivas. Además se encontró que la metilación del promotor puede influir en el comportamiento epigenético del primer exón en el gen hTERT. Por otra parte en este trabajo se observó que los tipos de VPH pertenecientes a la especie alfa 7 siempre se relacionan con un estado no metilado en la región del promotor, contrario a la especie alfa 9 que en el 95% de los tipos exhibe algún porcentaje de metilación. Lo que indica que posiblemente exista un mecanismo que asegure un estado libre de metilación en la región del promotor y este puede jugar un papel fundamental en la expresión de hTERT. Este es el primer trabajo a nivel mundial que establece una asociación entre el estado de metilación de dos regiones del gen hTERT con las especies y tipos de VPH de alto riesgo en muestras de pacientes con cáncer cervical invasivo.