Identificación de una enzima involucrada en el metabolismo del NAD+ en Leishmania braziliensis, la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (LbNAPRT)
ilustraciones, fotografías
- Autores:
-
Gutiérrez Gutiérrez, Cristian Alirio
- Tipo de recurso:
- Fecha de publicación:
- 2023
- Institución:
- Universidad Nacional de Colombia
- Repositorio:
- Universidad Nacional de Colombia
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.unal.edu.co:unal/84081
- Palabra clave:
- Bioquímica
Enzimas-análisis
Reacciones químicas
Paracitos
Enzymatic analysis
Chemical reactions
Parasites
NAD+
Nicotinato fosfo-ribosil transferasa
Leishmania braziliensis
LbNAPRT
- Rights
- openAccess
- License
- Reconocimiento 4.0 Internacional
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Identification of an enzyme involved in the metabolism of NAD+ IN Leishmania braziliensis, nicotinate phospho-ribosyl transferase (LbNAPRT |
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Reconocimiento 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Ramírez Hernández, María Helena3cd22161e24a39009214e3120ed6f39bGutiérrez Gutiérrez, Cristian Aliriod795d9e16bc2c4e23e2725437ea89ac9Laboratorio de investigaciones básicas en bioquímica (LIBBIQ)Gutiérrez Gutiérrez, CristianGutiérrez Gutiérrez, CristianGutiérrez Gutiérrez, CristianGutiérrez Gutiérrez, CristianGutiérrez Gutiérrez, Cristian2023-06-27T16:34:13Z2023-06-27T16:34:13Z2023-02-08https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/84081Universidad Nacional de ColombiaRepositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiahttps://repositorio.unal.edu.co/ilustraciones, fotografíasLa leishmaniasis es una enfermedad causada por el parásito protozoario del género Leishmania que, en países como Afganistán, Argentina, Colombia, Brasil, Irán, Siria, Etiopía, Sudan del norte, Costa Rica y Perú representan el 75 % del índice de prevalencia [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó un total de 1.5 millones de nuevos casos en 102 países incluyendo Colombia. En la actualidad los medicamentos utilizados para el tratamiento de esta parasitemia como los antimoniales pentavalentes causan diversos efectos secundarios por lo cual, es necesario identificar nuevos blancos farmacológicos efectivos [2]. De esta forma el metabolismo energético podría ser considerado relevante en la búsqueda de posibles dianas farmacológicas, ya que es esencial para el mantenimiento de la integridad celular del protozoario [3]. En este contexto la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (NAPRT) es una proteína de interés, debido a que determina los niveles de NAD+ intracelular. La NAPRT es la proteína encargada de sintetizar el mononucleótido de ácido nicotínico (NAMN) a partir del ácido nicotínico (NA) y la 5-fosfo-α- D -ribosa 1-difosfato (PRPP), siendo esencial en la vía de Preiss-Handler al regular los niveles del NAD+ en el parásito. En este trabajo se identificó la NAPRT en Leishmania braziliensis (LbNAPRT). Al analizar la secuencia in silico se observaron características asociadas a la interacción con los sustratos, regiones de posible oligomerización y de regulación alostérica. El análisis experimental se llevó a cabo mediante la generación de la proteína recombinante (LbNAPRT6xHis) en el sistema heterólogo E.coli. Se partió de ADN genómico de promastigotes de L. braziliensis para amplificar la secuencia codificante y construir el vector recombinante pET-22b+LbNAPRT. La proteína obtenida se empleó para el estudio de su funcionalidad en ensayo enzimático directo. A partir de la producción de proteína recombinante en el sistema heterólogo de E.coli se generó una herramienta inmunológica en modelo aviar, contra la LbNAPRT6xHis. Adicionalmente se realizaron ensayos de western blot e inmunofluorescencia para determinar la localización intracelular de la proteína, la cual presenta una ubicación a nivel citoplasmático en el estadio promastigote del parásito. Los resultados obtenidos constituyen un paso importante en el metabolismo del NAD, ya que se logró identificar funcionalmente la nicotinato fosfo-ribosil transferasa de Leishmanian braziliensis, esencial para la síntesis de los precursores del NAD+, como la primera NAPRT en protozoarios de importancia en la salud pública. (Texto tomado de la fuente)Leishmaniasis is a disease caused by the protozoan parasite of the genus Leishmania which, in countries such as Afghanistan, Argentina, Colombia, Brazil, Iran, Syria, Ethiopia, North Sudan, Costa Rica and Peru represent 75% of the prevalence rate [1]. The World Health Organization (WHO) reported a total of 1. 5 million new cases in 102 countries including Colombia. Currently, the drugs used for the treatment of this parasitaemia, such as pentavalent antimony drugs, cause various side effects, so it is necessary to identify new effective pharmacological targets [2]. In this way, the energy metabolism could be considered relevant in the search for possible pharmacological targets, since it is essential for the maintenance of the cellular integrity of the protozoan [3]. In this context, nicotinate phosphoribosyl transferase (NAPRT) is a protein of interest because it determines intracellular NAD levels. NAPRT is the protein responsible for synthesizing nicotinic acid mononucleotide (NAMN) from nicotinic acid (NA) and 5-phospho-α-D -ribose 1-diphosphate (PRPP), being essential in the Preiss-Handler pathway by regulating NAD+ levels in the parasite. In this study NAPRT was identified in Leishmania braziliensis (LbNAPRT). When analyzing the in silico sequence, characteristics associated with the interaction with the substrates, regions of possible oligomerization and allosteric regulation were observed. The experimental analysis was performed by generating the recombinant protein (LbNAPRT6xHis) in the heterologous E. coli system. Genomic DNA from promastigotes of L. braziliensis was used to amplify the coding sequence and construct the recombinant vector pET-22b+LbNAPRT. From the production of recombinant protein in the heterologous system of E. coli, an immunological tool against LbNAPRT6xHis was generated in an avian model. Additionally, western blot and immunofluorescence assays were performed to determine the intracellular localization of the protein, which is located at the cytoplasmic level in the promastigote stage of the parasite. The results obtained constitute an important step in NAD metabolism, since it was possible to functionally identify the nicotinate phosphor-ribosyl transferase of Leishmania braziliensis, essential for the synthesis of NAD+ precursors, as the first NAPRT in protozoa of public health importance.División de investigación de la universidad nacional de Colombia sede bobota código: 203010035591• Estudiar a fondo las modificaciones postraduccionales que se infiere en el alineamiento bioinformático (His240, Tyr21) de la proteína LbNAPRT ya sea por inmunoprecipitación de la enzima o por mutagénesis dirigida a este sitio. • Por otro lado, en torno a las propiedades cinéticas de la proteína LbNAPRT6xHis, se requerirá un estudio a profundidad de los parámetros enzimáticos de afinidad por los sustratos NA y PRPP, usando como control la proteína HsNAPRT. • Con respecto a la expresión de la proteína recombinante LbNAPRT6xHis en el sistema heterólogo de E. coli, se recomienda aumentar la solubilidad de la proteína como, por ejemplo, re clonando la secuencia codificante en un vector de expresión que genere un tag más expuesto que le brinde mayor solubilidad, con el fin de establecer mejores condiciones de purificación y facilitar el estudio de la funcionalidad de esta enzimaMaestríaMagíster en Ciencias - Bioquímica6.2.4 Expresión de la proteína recombinante El vector recombinante pET-22b+LbnNAPRT se expresó en el sistema heterólogo de E. coli BL21 (DE3), las células se recuperaron en medio SOC e incubaron durante 1 hora a 37°C. Las células se dejaron crecer en medio Luria Broth (LB) en una dilución de 1:50 (cultivos), suplementado con Ampicilina 100µg/mL a 37°C en agitación constante (100 rpm) hasta alcanzar O.D 600nm de 0.6; la expresión se indujo con Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0.5mM, durante periodos de 2 horas a 25°C, como se estableció tras la optimización de estas condiciones. La expresión se monitoreo mediante SDS–PAGE y western blot usando αHisx6 (1:5000) y revelado con α mouse-Fosfatasa alcalina (1:10000). Las bacterias fueron centrifugadas a 6000 rpm/ 15min y el pellet obtenido fue tratado con buffer de lisis (50 mM Fosfato de potasio, pH 7.8, 400 mM NaCl, 100 mM KCl, 10% Glicerol, 0,5% TritonX 100, 10 mM Imidazol) se usó 5mL / gramo de pellet húmedo celular, 1mg/mL lisozima y 1:400 Inhibidor de proteasas. Se incubó la mezcla a 4°C durante 1 hora. Posteriormente la muestra se sónico a (50% amplitud, pulsos de 15s y reposo de 45s durante 3min) en baño de hielo. Se centrifugó a 12000 rpm. por 20 min a 4°C (rotor Microliter 30x2 sealed 75003652 ThermoFisher, Heraeus Megafuge 16R 75004271 ThermoFisher), separando las fracciones solubles e insolubles. Estos extractos fueron analizados mediante SDS-PAGE y western blot revelado con BCIP y NBT [43]. 6.2.5 Purificación de la proteína LbNAPRT por cuerpos de inclusión La fracción insoluble de la lisis se homogenizó con buffer de lavado 1 (Tris-HCl 100mM pH 7.0, EDTA 5mM, Ditiotreitol 5mM, Urea 2M y Triton X-100 al 2%) 5mL por cada gramo de células húmedas, luego se centrifugó a 12000rpm durante 30min, este procedimiento se repitió 3 veces. El pellet obtenido se homogenizó nuevamente con buffer de lavado 2 (Tris-HCl 100mM pH 7.0, EDTA 5mM y Ditiotreitol 5mM) y centrifugó a las mismas condiciones. Finalmente, se resuspendió con el buffer de extracción (Tris-HCl 50mM pH 7.0, EDTA 5mM, Ditiotreitol 5mM y guanidina-HCl 8M) y se centrifugó a 14000rpm durante 1 h. El sobrenadante se recuperó y dializó a 4°C durante 16 horas en buffer Tris-HCl 50mM y NaCl 150mM, empleando una membrana (MWCO, Molecular Weight Cut-Off) de 10kDa. posteriormente se centrifugó 12000rpm por 20min, la proteína recuperada se desnaturalizó (90°C) y se cargó (buffer de carga 1X) en un gel preparativo (SDS-PAGE 20x20cm), utilizando un marcador preteñido (Opti-Protein Marker, abm) para realizar el corte de la banda en el gel correspondiente al peso molecular esperado para la proteína recombinante (47.85kDa). Las bandas (inferior, media y superior) se cortaron, maceraron y eluyeron con agua MilliQ a 37°C en agitación constante durante 16 horas. La muestra, se centrifugó a 5000g por 10min, recuperando el sobrenadante. Los eluidos recuperados, se cuantificarón y el proceso se monitoreo por SDS-PAGE 12% y western blot revelado con BCIP y NBT [44]. 6.2.6 Purificación por cromatografía de afinidad a metales acoplados La fracción soluble que contiene la proteína recombinante LbNAPRT6xHis se incubó con la resina HisPur™ Ni-NTA Resin High Density, (1mL de resina por 8mL de fracción soluble), esta se equilibró con buffer de unión (50 mM Fosfato de potasio, pH 7.8, 400 mM NaCl, 100 mM KCl, 10% Glicerol, 0,5% TritonX-100) durante 1 hora a 4°C en agitación constante. La mezcla se empacó en la columna y se extrajeron las proteínas no unidas, posteriormente se aplicó el siguiente gradiente: 10mM, 20mM, 50mM, 75mM ,150mM, 200mM y 300mM de Imidazol en el buffer 50mM Fosfato de potasio, pH 7.8, (400mM NaCl, 100mM KCl, 10% Glicerol, 0,5% TritonX-100). Se recolectaron las fracciones y se evaluaron mediante SDS-PAGE 12% y western blot [45]. 6.2.7 Evaluación de la actividad enzimática mediante ensayo directo Se realizó una mezcla de reacción que contenía 25mM HEPES/KOH pH 7.4, 7.4mM MgCl2, 1.25mM ATP, 1.25mM NA y 1.25mM PRPP. La reacción se inició al adicionar 5µg de las muestras a evaluar [46]. Las reacciones enzimáticas se incubaron a 37°C durante 5min y se detuvo agregando 100µL de HCLO4 1.2 M frío, la mezcla se incubó 15 minutos en hielo, posteriormente se centrifugó a 12000g durante 3 min, se recuperó el sobrenadante y se tomaron 150µL de la reacción y se neutralizaron con 40µL de K2CO3, se incubó y centrifugó a las mismas condiciones. Finalmente se tomaron 150µL de esta reacción para analizar mediante RP-HPLC, usando una columna C18 de 25cm de largo x 4.6 mm de diámetro interno, con un tamaño de partícula de 5µm (Phenomenex) en el cromatógrafo Hitachi. Se realizó un gradiente de elución utilizando el buffer A (0.1mM fosfato de potasio, pH 6.0) y B (metanol): 7 min buffer A (100%), 3.5 min buffer B (20%), 5 min buffer B (25%), 6.5 min buffer B (25%), 6.6 min buffer A (100%) [46], [47]. Las separaciones se efectuaron a temperatura ambiente con un flujo de 1ml/min, inyectando 5µL de muestra. La longitud de onda empleada fue 254 nm [13], [48]. 6.2.8 Producción de anticuerpos IgYs aviares contra la proteína LbNAPRT6xHis A partir de la proteína purificada por cuerpos de inclusión, se produjo una herramienta inmunológica IgYs contra la proteína recombinante, en gallinas de la raza hy line Brown de 50 semanas de edad [49]. Usando entre 50-150 ng de antígeno (LbNAPRT6xHis) en una relación 1:1 de adyuvante completo en la primera inoculación e incompleto en los dos periodos posteriores [50]. Se recolectaron 1mL de sangría durante el periodo de inmunización (3) y huevos (30). La presencia de los anticuerpos en sangre contra el recombinante, se evaluaron contra 250ng de antígeno y 250ng de BSA usando western blot (α-LbNAPRT- IgY 1:5000, anti-Chicken fosfatasa alcalina 1:10000, revelado con BCIP y NBT). 6.2.9 Inmunodetección de la proteína LbNAPRT endógena Para la detección de la proteína LbNAPRT se emplearon promastigotes de L. braziliensis cepa MHOM/BR/75M2904, cultivados en medio Schneider el cual se suplementado con suero fetal bovino 10% (V/V) a una temperatura de 26°C, en flasks de 25cm2 (T25), sin agitación. Para reconocer la proteína LbNAPRT endógena, se utilizó extractos celulares de aproximadamente 7,05x108 promastigotes de L. braziliensis (MHOM/BR/75M2904), los cuales se obtuvieron por centrifugación a 6500 rpm (rotor Microliter 30x2 sealed 75003652 ThermoFisher, Heraeus Megafuge 16R 75004271 ThermoFisher) por 10min a 4°C, realizando 2 lavados con 10mL de PBS 1x pH 7.4. Este extracto se resuspendió en 500µL de buffer de lisis (PBS 0.1x, cóctel de inhibidores de proteasas (1:250), TritonX-100 0.1%). Se incubó durante 40min a 4°C en agitación constante. Posteriormente se centrifugó durante 20min a 12000rpm a 4°C, con el propósito de separar las fracciones. A la fracción soluble se le agregó buffer de carga 6x (1:5) para SDS- PAGE y a la insoluble 200µL de 1x y se desnaturalizarón a 90°C. La fracción de proteínas totales se obtuvo lisando cerca de 1x105 células/µL de parásitos con buffer 1x (celulares totales). Las muestras fueron analizadas mediante SDS-PAGE 12% y WB (anticuerpos primarios αLbNAPRT6xHis-IgY 1:1000 purificados, revelado con BCIP y NBT) [51].Metabolismo energético de parásitos protozoarios93 páginasapplication/pdfspaUniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - BioquímicaFacultad de CienciasBogotá,ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede BogotáBioquímicaEnzimas-análisisReacciones químicasParacitosEnzymatic analysisChemical reactionsParasitesNAD+Nicotinato fosfo-ribosil transferasaLeishmania braziliensisLbNAPRTIdentificación de una enzima involucrada en el metabolismo del NAD+ en Leishmania braziliensis, la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (LbNAPRT)Identification of an enzyme involved in the metabolism of NAD+ IN Leishmania braziliensis, nicotinate phospho-ribosyl transferase (LbNAPRTTrabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TMOrganización Mundial de la Salud, Leishmaniasis en las Américas. 2020L. 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