Generación de microportadores basados en mezclas de alginato de sodio y fibrinógeno (2013)
Los equivalentes tisulares son dispositivos artificiales que deben cumplir funciones similares a las del tejido que se quiere reemplazar. Muchas de las funciones de cada tejido son llevadas a cabo por células especializadas, cuyo crecimiento y supervivencia requiere de la existencia de un sustrato físico sobre el cual las células puedan anclarse. En el cuerpo humano tal sustrato es la matriz extracelular, pero en equivalentes tisulares al sustrato en mención usualmente se le denomina soporte. En el mercado ya existen múltiples equivalentes de piel que varían en el grado de complejidad, la presencia o no de células y el material de soporte empleado. El análisis de tales alternativas fue el objeto del capítulo 1, el cual presenta una revisión de la literatura en lo concerniente a equivalentes de piel comercialmente disponibles, sus pros y contras y las áreas que necesitan desarrollo. El plasma sanguíneo humano (PH) es un material ampliamente estudiado para fabricar soportes usados en ingeniería de tejidos gracias a su contenido de fibrinógeno, proteína que puede polimerizarse para formar una red de fibrina; tal red puede servir de albergue para células y promueve su proliferación, así como la síntesis de matriz extracelular. Además, es biocompatible, biodegradable y como puede obtenerse directamente de la sangre, hace posible su aplicación para trasplantes autólogos. Sin embargo, los geles de fibrina obtenidos a partir de PH son frágiles y difíciles de manejar, cualidades indeseables durante un procedimiento quirúrgico. Con el fin de mejorar las propiedades mecánicas de los geles obtenidos a partir de plasma sanguíneo humano, en el capítulo 2 del presente proyecto se evaluaron dos estrategias: la primera consistió en la combinación del PH con alginato de sodio, sustancia que tiene el mismo mecanismo de gelificación que el fibrinógeno (intercambio iónico con Ca+2); la segunda consistió en el aumento de la concentración de fibrinógeno mediante crioprecipitación de PH para formar plasma humano crioprecipitado (PHCC). Las propiedades mecánicas de los geles obtenidos usando ambas estrategias se determinaron mediante reología dinámica; los resultados muestran que los geles fabricados a partir de PHCC tienen una resistencia mecánica mayor que los fabricados a partir de alginato de sodio, a partir de mezclas de alginato y PH o a partir de mezclas de alginato y PHCC; en todos los casos, la resistencia mecánica fue mayor a mayores concentraciones de Ca+2. Las mejores propiedades mecánicas del gel de PHCC comparadas con las de PH, permiten sugerir su uso como material de soporte para ingeniería de tejidos sin las complicaciones adicionales de bioadhesion y biodegradabilidad que implica el uso de alginato. Sin embargo, el elevado tiempo de formación de gel con PHCC (de 10 a 30 min) y la necesidad de controlar la temperatura a valores muy específicos (37 ± 1 °C) dificulta su uso para la generación de soportes a alta velocidad con formas preseleccionadas, como las requeridas para formar las microesferas de las que se habla en el capítulo 3; en dicho caso, la mezcla PHCC+1% p/v de alginato de sodio resulta más conveniente. El desarrollo de equivalentes de piel con células requiere de la disponibilidad apropiada de estas últimas; el uso de células del propio paciente resultaría ideal para evitar cualquier problema de tipo imunológico. Desafortunadamente, en la mayoría de los casos la disponibilidad de células de piel del propio paciente es limitada como resultado de su condición patológica. Como alternativa, la expansión in vitro de una pequeña cantidad de células obtenidas del paciente mediante una biopsia podría vencer tal limitación, con tal que dicha expansión sea suficientemente rápida para proveer las células en un plazo prudente, de manera que el tratamiento llegue al paciente a tiempo para ayudarle en su recuperación. Para aumentar la velocidad de crecimiento se propone el uso de un biorreactor en donde se mantengan condiciones óptimas de pH, temperatura, oxígeno disuelto y nutrientes. Sin embargo, como ya se mencionó anteriormente, el cultivo de células de piel requiere de un soporte sólido con suficiente área superficial para alojar la cantidad total de células necesarias; este requerimiento puede ser provisto fácilmente mediante el uso de microportadores. La primera parte del capítulo 3 describe la elaboración de microportadores basados en una solución de alginato de sodio al 1% p/v, solución que se usó como modelo para realizar el montaje de una metodología experimental, para detectar y solucionar problemas y obtener unas condiciones finales de operación, sin gastar plasma humano. Esta metodología fue posteriormente aplicada a la elaboración de microportadores basados en mezclas de plasma sanguíneo crioconcentrado (PHCC) y alginato de sodio al 1% p/v. Finalmente, en el capítulo 4 se describe la metodología empleada para la evaluación de la adhesión celular y la citotoxicidad tanto en geles planos de PHCC y sus respectivas mezclas con alginato de sodio (al 0,5% y 1,0 % p/v), como en microportadores de PHCC y alginato de sodio al 1% p/v. La citotoxicidad de los materiales se determinó empleando el procedimiento descrito en la norma ISO 10993-5 para dispositivos médicos que involucra la elución de extractos del material y su aplicación en un cultivo celular seguida por conteo por MTT. Los resultados indican que ninguno de los materiales evaluados resultó citotóxico. Igualmente se realizó la evaluación de la adhesión celular empleando técnicas de microscopía confocal y fluorescencia, usando Hoechst® para la tinción de núcleos de fibroblastos murinos de la línea celular L929 y CFSE® para tinción de citoplasma; se encontró que las células se adhirieron en todos los soportes seleccionados, incluyendo los microportadores.