Desarrollo de un método molecular alternativo para la detección de cepas de mycobacterium tuberculosis con resistenciaextendidaa drogas

La Tuberculosis (TB), causada por el bacilo Mycobacterium tuberculosis, es una de las enfermedades más prevalentes a lo largo de la historia de la humanidad. A pesar de los esfuerzos realizados en los últimos años, su control se ha visto afectado por el surgimiento de cepas del microorganismo resistentes a los antibióticos empleados en su tratamiento, lo cual es consecuencia de un diagnóstico retardado y de una quimioterapia inadecuada. Específicamente, algunas mutaciones puntuales en los genes involucrados en el mecanismo de acción del antibiótico son causantes de la resistencia a los medicamentos. En el presente trabajo, se desarrolló y adaptó una metodología basada en hibridación reversa en línea para la detección de cepas de M.tuberculosis resistentes a antibióticos. Se propuso el desarrollo de tres formatos para detectar simultáneamente las mutaciones puntuales asociadas a resistencia, por medio de un sistema de amplificación/hibridación reversa basado en los mismos principios experimentales del “spoligotyping”, técnica ampliamente utilizada para la genotipificación de micobacterias. La modificación propuesta en este trabajo comprende la adición de la amina cuaternaria cloruro de tetrametilamonio al buffer de hibridación, la que permite realizar todo el proceso de hibridación a una misma temperatura independiente del contenido de G:C de las sondas La primera plataforma propuesta denominada RIOT, comprende 9 sondas diseñadas en las zonas donde se presentan las mutaciones de los genes rpoB, katG, e inhA, y es útil para detectar cepas multidrogo resistentes que presenten resistencia a rifampicina e isoniazida. La segunda plataforma, llamada RIOT-X, es útil para detectar cepas con resistencia extendida y comprende un total de 19 sondas que permitan identificar mutaciones en los genes gyrA, gyrB, rrs y tlyA, brindando información sobre la resistencia para antibióticos de primera y segunda línea. Estas plataformas se evaluaron con muestras de ADN extraídas de aislados clínicos bien caracterizados, los resultados obtenidos fueron comparados con resultados de secuenciación y ensayos de susceptibilidad. Ambos formatos desarrollados arrojaron resultados de sensibilidad y especificidad comparables con los métodos disponibles comercialmente, y mostraron ventajas como la capacidad de procesar 41 muestras simultáneamente, contar con réplicas técnicas simultáneas, fácil implementación y bajo costo en comparación con los disponibles comercialmente. Con el objetivo de evaluar la posibilidad de aumentar la cobertura del ensayo, se intentó la estandarización del mismo formato diseñado en el RIOT pero en lámina de vidrio en un sistema de microarreglo, con resultados poco satisfactorios. Basados en los resultados obtenidos en este proyecto las múltiples ventajas ofrecidas por la plataforma estandarizada en membrana, se seleccionó ésta como la herramienta óptima entre los formatos propuestos para la detección de mutaciones que confieren resistencia a antibióticos en M. tuberculosis. / Abstract. Tuberculosis (TB), caused by the bacillum Mycobacterium tuberculosis, is one of the most prevalent diseases in the human history. Although a long effort has been made in the last decades, TB control have been affected by the emergence of drug resistant related to mutations in the genes involved in the drug mechanism, as consequence of retarded and expensive diagnostic and wrong chemotherapy. In this work, one reverse hybridization-based methodology was adapted and standardized for the detection of drug resistant M. tuberculosis strains. This approach includes the design of three different formats which allow identifying drug-resistant associated single nucleotide polymorphisms, through an amplification/reverse hybridization system, which is based on the same experimental principles of the “spoligotyping”, a widely used technique for mycobacterial genotyping, The innovation proposed in this work includes the addition of the quaternary ammine, tetramethyl ammonium chloride in the hybridization/washing buffer. This reagent allows making all the process at the same temperature, independently of the G:C content of the oligonucleotide probes The first platform, called Rifampin-Isoniazid Oligotyping RIOT. includes 9 probes designed in the most common frequent mutated regions of the rpoB, katG, e inhA genes, and is useful for detect multidrug resistance strains by the detection of mutations in the rifampin and isoniazid target genes. Similarly, the standardization and evaluation of a second platform called RIOT-X. useful in the detection of extended resistance strains, includes 19 probes for detect mutations in the genes gyrA, gyrB, rrs y tlyA and allows having information about resistance to first and second line drugs. These assays were standardized and evaluated with DNA samples extracted from well - caracterizated strains, and the results were compared with sequencing and drug susceptibility testing. The main advantages of the proposed methods are: the capacity to run simultaneously 41 samples, the inclusion of technical replicates in the same assay, the user-friendly laboratory procedure and the low cost in comparison with commercial available tests. The adaptation of the first designed platform to glass slides in a microarray format was evaluated in order to explore the possibility to increase the coverage of the test. Unfortunately, this platform showed not satisfactory results. Therefore, due to the results obtained in this project, the membrane platform was chose as the best practical tool for detection of drug resistant-associated mutations in M. tuberculosis.

• Autores: Hernández-Neuta, Jorge Iván
• Fecha de publicación: 2011
• Institución: Universidad Nacional de Colombia
• Repositorio: Universidad Nacional de Colombia
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unal.edu.co:unal/8576
• Acceso en línea: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/8576; http://bdigital.unal.edu.co/5244/
• Palabra clave: 54 Química y ciencias afines / Chemistry; 61 Ciencias médicas; Medicina / Medicine and health; Tuberculosis resistente a drogas; Mutaciones puntuales; Diagnóstico molecular; Hibridación reversa en línea; Spoligotyping; Cloruro de tetrametil amonio; Molecular diagnostic tools; Reverse hybridization; Spoligotyping; tetramethyl ammonium chloride; Drug resistant tuberculosis; Single nucleotide polymorphisms
• Rights: openAccess
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