Caracterización de la nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenilil transferasa de Leishmania braziliensis (LbNMNAT) mediante análisis estructural y de interacción proteína-proteína

Los parásitos del género Leishmania son los agentes causales de la leishmaniasis, enfermedad endémica en regiones tropicales y subtropicales, que afecta a miles de personas en el mundo. Las estrategias farmacológicas actuales generan numerosos efectos secundarios, por lo que es necesario desarrollar tratamientos que controlen el parásito sin afectar al hospedero. La enzima NMNAT (EC: 2.7.7.1/18) representa una diana terapéutica promisoria, dado que cataliza el paso final en la biosíntesis del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD) y/o del dinucleótido de adenina y ácido nicotínico (NaAD), metabolitos esenciales en múltiples procesos celulares. Como parte de la caracterización e identificación de la NMNAT de L. braziliensis (LbNMNAT), se realizó un análisis bioinformático, comparando NMNATs del género Leishmania con las tres isoformas humanas, con lo cual se logró determinar la existencia de inserciones exclusivas en la secuencia de aminoácidos de la enzima del parásito. Dada la importancia de estas inserciones como componentes estructurales propios de la LbNMNAT, se realizó el estudio in vitro de los mutante Δ8-42LbNMNAT y Δ241-249LbNMNAT, al igual que del mutante Δ1-104LbNMNAT. Se diseñaron las respectivas recombinantes a partir de análisis de modelos estructurales predictivos, tecnologías de ADN recombinante y estrategias de mutagénesis delecional. La expresión de las proteínas se efectúo en la cepa E. coli SHuffle T7 express y su purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad a níquel. La actividad catalítica de las proteínas parcialmente purificadas se evaluó tanto por ensayos enzimáticos acoplados como directos. Se encontró que la deleción 1-104 afecta uno de los motivos de unión a ATP, modificando la arquitectura del plegamiento Rossmann de la proteína conllevando a la inactivación de la enzima. Por su parte, la deleción 241-249, elimina un elemento estructural clave que conecta los dominios α/β y C-terminal disminuyendo drásticamente la solubilidad y actividad enzimática de la proteína recombinante correspondiente. Por otro lado, para ampliar el conocimiento funcional de la LbNMNAT por interacción con otras proteínas, a partir de fracciones soluble de promastigotes de L. braziliensis transfectados con el vector pSP72αneoαLbNMNAT-GFP, se realizaron ensayos de co-inmunoprecipitación acoplada a espectrometría de masas (Co-IP-MS/MS), identificando 38 proteínas que fueron clasificadas según su función celular. Se analizaron candidatos relacionadas con plegamiento de proteínas, homeóstasis redox y traducción, sugiriendo nuevas funciones celulares en las que puede participar la enzima. A nivel in silico, empleando STRING, se construyó una red de interacción proteína-proteína conformada por 11 nodos y 16 conexiones. La red fue enriquecida funcionalmente con las bases de datos KEGG, PFAM e INTERPRO, en donde 5 de las proteínas están relacionadas con la ruta metabólica del nicotinato y la nicotinamida, y cuatro con motivos de unión a ARN, en este caso, se adjudica que la mayoría de las interacciones son de tipo funcional. Con estas herramientas se da el paso inicial en la construcción de un modelo de interacción de proteínas con la LbNMNAT para establecer nuevas rutas funcionales.

• Autores: Ortiz Joya, Lesly Johanna
• Fecha de publicación: 2018
• Institución: Universidad Nacional de Colombia
• Repositorio: Universidad Nacional de Colombia
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unal.edu.co:unal/64043
• Acceso en línea: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/64043; http://bdigital.unal.edu.co/64761/
• Palabra clave: 54 Química y ciencias afines / Chemistry; 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology; Leishmania braziliensis; Dinucleótido de Adenina y Nicotinamida (NAD+); Nicotinamida/Nicotinato Mononucleótido Adenililtransferasa (NMNAT),; interacción de proteínas
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