Clonación y expresión en Escherichia coli del gen ctpE Rv0908) de Mycobacterium tuberculosis: determinación preliminar de su posible actividad Na+ATPasa (2012)
La tuberculosis es uno de los desafíos más importantes para la salud pública en el mundo. Actualmente hay una prevalencia de 2 billones de personas infectadas con Mycobacterium tuberculosis, lo que representa el 30% de la población mundial. En la actualidad, entre los blancos terapéuticos de mayor interés para el control de patógenos intracelulares se encuentran las proteínas de membrana plasmática encargadas del transporte iónico: ATPasas, transportadores ABC y sistemas antiporter ion/H+ (Novoa et. al. 2012). De hecho, la regulación de la concentración de iones metálicos es central en la fisiología de la interacción hospedero- patógeno y ambos han desarrollado mecanismos sofisticados para el transporte de iones hacia el interior o el exterior celular dependiendo de sus necesidades (Soldati y Neyrolles, 2012). Estudios genómicos de M. tuberculosis evidenciaron que existen 28 secuencias que codifican para transportadores putativos de iones metálicos, entre ellos 12 ATPasas tipo P (Novoa et. al., 2012; Agranoff y Krishna, 2004, 1998). Este gran número de ATPasas (el mayor número reportado para una bacteria), puede dar la versatilidad requerida al bacilo para adaptarse a las condiciones intra- y extracelulares durante las diferentes etapas de la infección, las cuales difieren marcadamente en osmolaridad, concentraciones de iones metálicos, pH y disponibilidad de nutrientes. Estudios bioinformáticos, permitieron clasificar a las ATPasas tipo P de M. tuberculosis CtpA, CtpB, CtpC, CtpD, CtpG, CtpJ y CtpV como transportadores de metales pesados (Cu2+, Cu+, Cu+/ Cu2+, Zn2+ y Co2+/Ni2+); a CtpE, CtpF, CtpH y CtpI como transportadores de iones de metales alcalinos y alcalinotérreos (Na+, K+, Ca2+, H+ y Mg2+); y a KdpB, como una proteína que tiene alta identidad con la subunidad ß de una ATPasa multimérica transportadora de K+ de E. coli (Novoa et. al. 2012). Sin embargo, la especificidad de sustrato para estas ATPasas solo ha sido establecida experimentalmente para tres de ellas. A partir de la creación de mutantes se ha logrado establecer que CtpD es una Co2+/Ni2+ - ATPasa (Raimunda et. al. 2012) y que CtpV y CtpC son ATPasas transportadoras de Cu2+ y Zn2+, respectivamente. (Ward S. et.al. 2010 y Botella H. et.al. 2011). En nuestro grupo de investigación con anterioridad estableció la actividad ATPasa dependiente de Na+ en la membrana plasmática de M. tuberculosis. Dicha actividad se asoció a la presencia de una Na+ ATPasa tipo P, pues es inhibida por vanadato, un reconocido inhibidor de este tipo de bombas (Cuesta, 2010). Los estudios bioinformáticos también identificaron en el genoma del bacilo, al gen ctpE (Rv0908) de M. tuberculosis como posible codificante de una Na+ ATPasa tipo P. El presente trabajo busca establecer la especificidad iónica de la proteína codificada por el gen ctpE de M. tuberculosis. Específicamente, se logró la clonación del gen en el vector de expresión pBADA2 y la expresión heteróloga en células de E. coli del producto génico CtpE. También, los resultados de algunos ensayos bioquímicos y medidas electrofisiológicas, realizados en vesículas de membrana de E. coli, sugieren que la proteína CtpE corresponde a un transportador de Na+ y/o K+.