Identificación de marcadores de muerte celular que produce rotavirus WTEW en líneas tumorales REH y U937 (2014)
ANTECEDENTES El cáncer es la principal causa de muerte en países industrializados y segunda causa de muerte en países en vía de desarrollo. El número de pacientes con cáncer diagnosticado entre los años 2004 y 2008 fue de 28.8 millones [1, 2]. En la actualidad se intentan desarrollar diferentes tratamientos que incluyen la viroterapia oncolítica, en la cual los virus pueden ser utilizados en su estado silvestre, ser modificados genéticamente, pueden ser diseñados para depender de vías de señalización o programas de transcripción que se activan en células tumorales. Otros son diseñados teniendo en cuenta el proceso de entrada del virus a la célula y son modificados para que utilicen receptores celulares que solo se expresan en células tumorales [3]. Este enfoque ofrece seguridad en cuanto es específico de tumor, pero a la vez es una limitante porque el virus es específico solamente para los tumores que tengan dicho receptor celular. En la actualidad no se ha diseñado un virus con capacidad de actuar en los diferentes tipos de tumor o en todas las células que hacen parte de un tumor, incluso en tratamientos combinados con radioterapia y quimioterapia, debido a que los tejidos y cada una de las células tumorales presentan procesos biológicos y bioquímicos complejos. Según las consideraciones de la “Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)” es necesario primero caracterizar el virus oncolítico y para esto se requiere evaluar su selectividad, para lo cual necesita de ensayos de citotoxicidad in vitro y/o replicación en líneas celulares permisivas (tumorales) y en no permisivas (células normales). Rotavirus tiene la capacidad de infectar líneas celulares de cáncer como se ha demostrado en células Caco 2 [4] y células HT-29 [5] de adenocarcinoma colorrectal. En trabajos previos en el laboratorio de Biología Molecular de Virus de la Facultad de medicina de la Universidad Nacional, se encontró que al evaluar las células de la línea Sp2/0-Ag14de y U937 infectadas por rotavirus presentan permeabilidad de la membrana citoplasmática, se encuentran señales de inducción de muerte celular por apoptosis y disminuye el número de células durante el proceso infeccioso, sugiriendo que la infección viral trae como consecuencia primero apoptosis y luego lisis celular. Existen reportes de que la infección por el rotavirus induce muerte celular por apoptosis en las células intestinales humanas Caco-2 [6] y oncosis en células MA104 al inducir alteración en la integridad de la membrana citoplasmática, sin ocasionar fragmentación del DNA o formación de cuerpos apoptóticos [7]. Se ha reportado que la proteína rotaviral NSP1 suprime en las primeras 8 h.p.i. la muerte celular prematura por apoptosis, activando señales de supervivencia vía PI3K y después de esta h.p.i. la célula muere por apoptosis [8]. Igualmente, en trabajos previos de nuestro laboratorio se halló que las cepas de rotavirus seleccionadas en el laboratorio infectan y lisan la línea celular Sp40 Ag-14 (mieloma de ratón), U-937 (linfoma histiocitico), REH (leucemia linfocitica aguda), Kato III (carcinoma gástrico), J774 (sarcoma de células reticulares), MDA (adenocarcinoma de seno), PC3 (adenocarcinoma grado IV de próstata), sugiriendo que las cepas estudiadas son potenciales virus oncolíticos. Sin embargo, las señales de inducción de muerte celular por apoptosis encontradas en estas líneas tumorales analizadas, fue al cabo de 12 horas post-infección. Por lo cual hay evidencias preliminares que sugieren lisis celular por mecanismos apoptóticos, pero no se ha profundizado en determinar a cuanto tiempo de la infección se inician las señales de muerte, ni se han precisado los eventos bioquímicos característicos de muerte celular en líneas U937 y REH infectadas con rotavirus WTEW, ni la relación con la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO - ROS) y si estos efectos se modifican al aplicar antioxidantes en líneas U937 y REH infectadas con rotavirus WTEW. OBJETIVO: Determinar marcadores de muerte celular en líneas U937 y REH infectadas con rotavirus WTEW. MATERIALES Y MÉTODOS: Las líneas U937 y REH se infectaron con rotavirus WTEW con un MOI de 2, se analizó la presencia de antígenos rotavirales usando anticuerpos contra proteínas estructurales y no estructurales de rotavirus mediante inmunocitoquímica. Se evalúo la exposición de la fosfatifilserina, la fragmentación con tinciones de Hoescht e Ioduro de propidio y rupturas del DNA con las técnicas de TUNEL y PARP, pérdida de potencial de membrana mitocondrial con el marcador DiOC 6, la actividad metabólica utilizando ensayos de MTT y Resazurina, niveles de ROS con el DHE del kit Cellomics® Oxidative Stress I. La expresión de las proteínas celulares IKB, COX, NFKB, PPARγ, HSP90 y PDI por inmunofluorescencia. RESULTADOS: Encontramos que las líneas U937 y REH se infectaron con rotavirus. Se promovieron marcadores de muerte celular asociados con apoptosis como la exposición de fosfatidil serina a las 11 h.p.i., aumento de la fragmentación, rupturas del DNA, activación de mecanismos de reparación, disminución del potencial de membrana mitocondrial. Se identificó que la actividad metabólica no disminuye en las primeras h.p.i., y su disminución es dependiente del MOI con que son infectadas. Los niveles de ROS aumentan en células de la línea U937 cuando son infectadas y disminuyen en células pre-tratadas con N-acetilcisteina, Tiazonilediona, Rosiglitazona, Pioglitazona y Curcumina, en la línea REH los niveles disminuyen en células infectadas cuando son pre-tratadas con N-acetilcisteina y Tiazonilediona. Los niveles de infección disminuyen en células REH y U937 cuando son pretratadas con todos los medicamentos. Se encontró que en células REH la expresión de las proteínas celulares IKB, COX, NFKB, PPARγ, HSP90 y PDI no varían entre las células infectadas con rotavirus WTEW y las células infectadas y tratadas con NAC, mientras en células de la línea U937 se presenta disminución significativa en las proteínas IKB, NFκB fosforilado y COX II cuando las células son infectadas y tratadas con NAC. CONCLUSIÓN: La infección del rotavirus WTEW a las células REH y U937 induce marcadores de muerte celular característicos de apoptosis.