Actividad disulfuro isomerasa de la superficie celular sobre el rotavirus durante los eventos iniciales del proceso infeccioso

La entrada de los rotavirus a las células involucra un proceso complejo de múltiples pasos. Al menos tres tipos de receptores de superficie celular interactúan secuencialmente con las proteínas estructurales del virus, por un mecanismo que implicaría cambios conformacionales de las proteínas del vir...

Full description

Autores:: Calderón Ozuna, Martha Nancy

Tipo de recurso:: Doctoral thesis

Fecha de publicación:: 2010

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

Description
Summary:	La entrada de los rotavirus a las células involucra un proceso complejo de múltiples pasos. Al menos tres tipos de receptores de superficie celular interactúan secuencialmente con las proteínas estructurales del virus, por un mecanismo que implicaría cambios conformacionales de las proteínas del virion. En este trabajo, se describen los estudios que implican a la proteína disulfuro isomerasa (PDI) asociada a la membrana celular durante el proceso de entrada del rotavirus. Los resultados señalan que PDI está inmersa en los microdominios lípidicos rafts, asociada con la proteína Hsc70 y la integrina αvβ3. Dos bloqueadores del intercambio tiol-disulfuro, DTNB y bacitracina, que no permean la membrana celular inhibieron la infección por rotavirus en un 50%. La especificidad del bloqueo de la infección viral fue confirmada adicionando anticuerpos anti-PDI; éstos disminuyeron la infección viral en un 45%, mientras que anticuerpos anti- ERp57 no tuvieron efecto. La interferencia de los bloqueadores tiol-disulfuro fue abolida por adición de PDI exógena al inoculo viral; además se demostró la interacción de PDI con las partículas virales. Péptidos sintéticos que contenían cisteínas tanto de secuencias rotavirales como de secuencias no relacionadas con rotavirus afectaron el proceso infeccioso, cuando fueron incubados con las células MA104. Anticuerpos generados contra los péptidos sintéticos inhibieron la infección por rotavirus cuando fueron adicionados después de la unión del virus a las células. El análisis por ELISA de captura del complejo PDI-péptido, indica que existe interacción directa entre la proteína y los péptidos que contienen cisteínas. Los bloqueadores de la actividad disulfuro isomerasa (DTNB, bacitracina y anticuerpos anti-PDI), los péptidos sintéticos o sus anticuerpos anti-péptidos no inhibieron la unión del virus a la célula, tampoco afectaron el proceso de permeabilización celular inducida por el rotavirus en los primeros eventos de entrada a las células. PDI podría ser un potencial blanco de interferencia con agentes antivirales que reaccionen con enlaces disulfuro. / Abstract. The rotavirus entry mechanism seems to involve a complex multistep process in which at least three different cell surface receptors interact sequentially with virus structural proteins. Conformational changes affecting virus proteins have been suggested as part of this mechanism. In this work, we describe studies demonstrating cell membrane-bound protein disulfide isomerase (PDI) implication during the virus entry process. Results showed that PDI is associated with Hsc70, integrin αvβ3 and rotavirus particles in membrane micro-domains (lipid rafts) from MA104 cells. DTNB and bacitracin, two membrane-impermeant thiol/disulfide blockers, were able to decrease rotavirus infection by about 50%. Viral infection blockade specificity was further confirmed by adding anti-PDI antibodies, which decreased viral infection by about 45%, whereas anti-ERp57 antibodies had no effect on infection. Thiol/disulphide blockers’ inhibitory effect was abolished by addition of exogenous PDI to viral inoculums, and PDI-rotavirus particle interaction was demonstrated. Rotavirus and non-related synthetic peptides containing cysteine residues also significantly affected viral infection when added to cells. Antibodies to cysteine residue-containing rotavirus synthetic peptides mainly inhibited rotavirus infection of MA104 cells when such antibodies were added following virus attachment. Incubating PDI with VP4 and VP7 synthetic peptides, followed by ELISA detection of specific antibodies against the respective synthetic peptides, revealed that PDI interacted with virion protein-derived peptides. Thiol/disulfide blockers, synthetic peptides and anti-PDI antibodies were unable to interfering virus attachment to cell, and rotavirus-induced cell permeabilisation, whereas all of them affected virus infectivity. PDI could thus be a potential target for antiviral agents reacting with disulfide bonds.

Actividad disulfuro isomerasa de la superficie celular sobre el rotavirus durante los eventos iniciales del proceso infeccioso

Publicaciones similares