Contribución a la implementación de un ensayo de permeación bucal in vitro, empleando cafeína como compuesto modelo (2017)
Los estudios de permeación bucal in vitro empleando mucosa porcina se consideran útiles en el desarrollo temprano de formulaciones; sin embargo, a nivel mundial se ha reportado una falta de reproducibilidad al emplear tejidos animales atribuida a la ''variabilidad biológica'', por lo que, al implementar este tipo de ensayos en el Grupo de Investigación, se pretendió ahondar en las diferentes variables que pudieran tener influencia, empleando cafeína como compuesto modelo de moléculas hidrofílicas. Se validó una metodología analítica por cromatografía líquida de alta eficiencia con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) para la cuantificación de la cafeína, utilizando una columna de fase reversa C18 con detección UV a 273 nm y una fase móvil constituida exclusivamente por agua-acetonitrilo (80:20 v/v). Las características de desempeño evaluadas permitieron comprobar que existe una adecuada selectividad, una linealidad entre 0.5 y 50 ug/mL, con una precisión expresada como RSD menor a un 2%, un porcentaje de recuperación del 99.9% y unos límites de detección y cuantificación para el método de 0.85 y 2.69 ng/mL, respectivamente; así mismo, se evaluó la estabilidad sometiendo alícuotas tanto de la validación del sistema como del método a diferentes condiciones de tiempo y temperatura de almacenamiento, sin presentar una degradación significativa. Por medio del análisis de muestras histológicas de la mucosa bucal, la evaluación de esta membrana por el método de pérdida de agua transmucosa y los ensayos de permeación empleando celdas de Franz, se estudió el efecto de la técnica de separación, los medios, la temperatura y el tiempo de almacenamiento sobre la morfología celular y la organización del tejido, la integridad de la membrana y parámetros asociados a la permeación (flujo en estado estacionario, constante de permeabilidad y cantidad acumulada a las 4 horas). Se determinó que se pueden realizar cortes con bisturí o dermatomo sin alterar los parámetros de permeabilidad, mientras que la separación por calor presenta un comportamiento diferente. El almacenamiento de los tejidos en una solución de Krebs-Ringer-Bicarbonato a 4 °C, mantuvo el tejido en óptimas condiciones por 24 horas, mientras los procesos de congelación evidencian cambios a nivel de las células epiteliales superiores, pero en menor proporción cuando se usan criopreservantes con dimetilsulfóxido y suero fetal bovino. La medida de la integridad de la membrana, mediante la técnica de pérdida de agua transmucosa, demostró ser un buen indicador de este parámetro, siendo una alternativa rápida y poco explorada con mucosa bucal que permite seleccionar los tejidos para los ensayos de permeabilidad de manera práctica, pero que idealmente podría ser complementada con otras técnicas. En conclusión, mediante la realización de este trabajo de investigación se establecieron las condiciones de las variables para la implementación del ensayo de permeación bucal in vitro, para compuestos hidrofílicos, empleando cafeína como molécula modelo.