Síntesis de constructos de multicopias peptídicas de secuencias derivadas de la proteína apical sushi protein (asp) de plasmodium falciparum: caracterización fisicoquímica y estudios de inmunogenicidad

La malaria continúa siendo uno de los problemas de salud pública de mayor relevancia a nivel mundial. En la actualidad más del 40% de la población mundial que habita en las regiones tropicales y subtropicales son endémicas de esta enfermedad. Pese a las estrategias propuestas por entidades como la O...

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Autores:: Vanegas Murcia, Magnolia

Tipo de recurso:: Doctoral thesis

Fecha de publicación:: 2014

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

Description
Summary:	La malaria continúa siendo uno de los problemas de salud pública de mayor relevancia a nivel mundial. En la actualidad más del 40% de la población mundial que habita en las regiones tropicales y subtropicales son endémicas de esta enfermedad. Pese a las estrategias propuestas por entidades como la OMS y OPS, en el último año se registraron 216 millones de casos clínicos de malaria y cerca de 655.000 decesos por esta causa, mayoritariamente mujeres embarazadas y niños menores de cinco años de edad. Este problema se ha visto ostensiblemente agravado por múltiples circunstancias, entre estas los fuertes cambios climáticos de los últimos años que han permitido la colonización de nuevos territorios anteriormente carentes de malaria, la resistencia por parte del Plasmodium (agente causal de la enfermedad) a los diferentes esquemas de antibióticos empleados para su control y así mismo la resistencia de la hembra del mosquito Anopheles (vector de transmisión de la enfermedad) a los insecticidas más usados. Por lo anterior la búsqueda de nuevas estrategias tanto terapéuticas como inmunoprofilácticas sigue siendo una prioridad global. En la actualidad alrededor de 150 diferentes prototipos de vacuna contra la malaria se encuentran en diferentes fases de investigación sin resultados alentadores respecto a la prevención de la enfermedad. Sin embargo un esfuerzo importante realizado en los años ochenta, liderado por el Profesor Manuel Elkin Patarroyo y su equipo condujo a la obtención de la primera vacuna sintética contra esta enfermedad denominada SPf66, cuya eficacia protectora contra la enfermedad fue en promedio entre 30 a 50% en los diferentes estudios clínicos realizados en diferentes lugares del mundo. Desde entonces, este equipo de investigación ha venido ahondando en el estudio de los complejos mecanismos de infección empleados por el Plasmodium falciparum (especie de malaria letal al humano) para el desarrollo de una nueva generación de vacuna sintética multiestadío, multiantigénica y definida fisicoquímicamente como unidades macromoleculares. Como parte importante de este engranaje, hemos planteado en este trabajo la obtención de constructos macromoleculares sintéticos totalmente definidos. Para ello nos basamos en el diseño racional de inmunógenos modificados estratégicamente, provenientes de regiones no polimórficas de antígenos relevantes del Plasmodium que evidencien motivos o sitios clave para su unión a las células blanco del patógeno en estadios sanguíneos, en este caso al glóbulo rojo. Este tipo de modificaciones a nivel de estructura primaria de los antígenos nativos incluye la detección de posibles marcos de lectura por parte del HLA. Teniendo en cuenta lo anterior, seleccionamos un antígeno expresado en los organelos apicales de los estadios merozoito y esquizonte maduro del parasito denominado Apical Sushi Protein (PfASP), denominado así por poseer dominios tipo Sushi caracterizados por contener puentes disulfuro semejantes a los encontrados en moléculas de la cascada del complemento del sistema inmunológico humano. Una vez determinados cuatro péptidos con alta capacidad de unión a glóbulos rojos (denominados HABPs por High Activity Binding Peptides) codificados como 34259, 34270, 34273 y 34290 ubicados en diferentes lugares dentro de la estructura de 731 aminoácidos de PfASP, estos se sintetizaron como polímeros no controlados vía Cisteínas y se sometieron a evaluación de diferentes propiedades biológicas, entre ellas su capacidad citotóxica, hemolítica, antigénica y además fueron evaluados funcionalmente por su capacidad de evidenciar control de la infección por malaria en un modelo animal experimental de roedores previamente vacunados con estos polímeros y sus análogos modificados estratégicamente, esto teniendo en cuenta la alta semejanza estructural entre la proteína humana PfASP y secuencias ortólogas en Plasmodium berghei y Plasmodium yoelii. Con las secuencias de PfASP que evidenciaron perfiles de actividad funcional más relevantes, se decidió diseñar y elaborar constructos macromoleculares definidos tetraméricamente empleando varias estrategias para su posterior análisis, entre estas la síntesis de polímeros no controlados vía Cisteínas, constructos lineales obtenidos por condensación de bloque, dobles dímeros convencionales o asimétricos y finalmente dobles dímeros simétricos en los cuales se funcionalizaron residuos de lisina en el núcleo de propagación de este nuevo tipo de dendrímeros con el propósito de equiparar tanto las distancias como la reactividad de las funciones amino primaria respecto al carbono alpha. A algunos de los constructos se incorporaron secuencias blanco sustrato de Catepsinas (enzimas presentes a nivel lisosomal en las células profesionales fagocíticas APC) con el propósito de tratar de guiar la presentación antigénica de estos análogos sintéticos. Estos compuestos se obtuvieron con rendimientos diferenciales en cantidades suficientes para los ensayos de actividad funcional. Con esta batería de análogos sintéticos se realizaron nuevamente estudios de actividad citotóxica, hemolítica, antigénica e inmunogénica en ensayos de protección en grupos de animales experimentales, ratones BALB/c. Se encontró que algunos de estos constructos, como son los Dobles Dímeros Simétricos y Constructos Lineales por Condensación que contenían las secuencias blanco de Catepsinas y otros espaciadores como ácido aminohexanóico, evidenciaron controlar de manera eficiente los niveles de infección en los animales desafiados con las dos cepas de malaria murina. Los linfocitos B presentes en el bazo de aquellos animales que evidenciaron controlar la infección por malaria se sometieron a análisis del perfil de citoquinas secretadas y se encontró que en algunos casos la respuesta fue coherente con perfiles definidos Th2, otros Th1 preferencialmente y algunos una relación equiparable Th1-Th2, indicando la capacidad inmuno-estimuladora de este tipo de compuestos definidos fisicoquímicamente y evidenciando su papel en el campo de nuevas vacunas contra la malaria diseñadas racionalmente.

Síntesis de constructos de multicopias peptídicas de secuencias derivadas de la proteína apical sushi protein (asp) de plasmodium falciparum: caracterización fisicoquímica y estudios de inmunogenicidad

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