Inducción de resistencia sistémica en plantas de tomate contra Pseudomonas syringae pv. tomate por Pseudomonas spp
ilustraciones, diagramas, fotografías, mapas
- Autores:
-
Muñoz Ibañez, Laura Maria
- Tipo de recurso:
- Fecha de publicación:
- 2024
- Institución:
- Universidad Nacional de Colombia
- Repositorio:
- Universidad Nacional de Colombia
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.unal.edu.co:unal/86901
- Palabra clave:
- 500 - Ciencias naturales y matemáticas::507 - Educación, investigación, temas relacionados
630 - Agricultura y tecnologías relacionadas::631 - Técnicas específicas, aparatos, equipos, materiales
PSEUDOMONAS SYRINGAE
CYPHOMANDRA BETACEA
ACIDO SALICILICO
MEJORAMIENTO SELECTIVO DE LAS PLANTAS
INDICE DE SELECCION (MEJORAMIENTO DE LAS PLANTAS)
Pseudomonas syringae
Cyphomandra betacea
Salicylic acid
Plant-breeding
Selection indexes (plant breeding)
Cultivo del tomate
Pseudomonas syringae pv. tomate
Pseudomonas rizosféricas
Inducción de resistencia sistémica
Compuestos orgánicos volátiles
Ácido salicílico
Ácido jasmónico
Tomato cultivation
Rhizospheric Pseudomonas
Systemic resistance induction
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Salicylic acid
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- openAccess
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Induction of systemic resistance in tomato plants against Pseudomonas syringae pv. tomato by Pseudomonas spp |
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Inducción de resistencia sistémica en plantas de tomate contra Pseudomonas syringae pv. tomate por Pseudomonas spp 500 - Ciencias naturales y matemáticas::507 - Educación, investigación, temas relacionados 630 - Agricultura y tecnologías relacionadas::631 - Técnicas específicas, aparatos, equipos, materiales PSEUDOMONAS SYRINGAE CYPHOMANDRA BETACEA ACIDO SALICILICO MEJORAMIENTO SELECTIVO DE LAS PLANTAS INDICE DE SELECCION (MEJORAMIENTO DE LAS PLANTAS) Pseudomonas syringae Cyphomandra betacea Salicylic acid Plant-breeding Selection indexes (plant breeding) Cultivo del tomate Pseudomonas syringae pv. tomate Pseudomonas rizosféricas Inducción de resistencia sistémica Compuestos orgánicos volátiles Ácido salicílico Ácido jasmónico Tomato cultivation Rhizospheric Pseudomonas Systemic resistance induction Volatile organic compounds Salicylic acid Jasmonic acid |
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Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Bernal Giraldo, Adriana Jimenae7e4412fc355816dd6f4307128ecd4bcUribe Velez, Danielba846f8c83bd21911cd6a207da19fe9bMuñoz Ibañez, Laura Mariacc17ed4b3d8de79503ab7fd0ca2f6f322024-10-07T14:32:06Z2024-10-07T14:32:06Z2024https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/86901Universidad Nacional de ColombiaRepositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiahttps://repositorio.unal.edu.co/ilustraciones, diagramas, fotografías, mapasEl cultivo de tomate se destaca a nivel mundial por su importancia económica y valor nutricional, siendo esencial en la agricultura Colombiana con una producción significativa. Sin embargo, la peca bacteriana, causada por Pseudomonas syringae pv. tomate (Pst), amenaza los rendimientos con daños en hojas y frutos. A pesar del uso común de agroquímicos, con sus consecuencias ambientales negativas, estrategias como el control biológico con hongos y bacterias rizosféricas, especialmente del género Pseudomonas, emergen como alternativas sostenibles para inducir resistencia sistémica ante el estrés biótico y prevenir enfermedades. Las plantas, con defensas constitutivas y mecanismos de respuesta, despliegan respuestas clave ante amenazas de herbívoros, patógenos y estres ambiental. La inducción de resistencia en plantas se activa mediante compuestos orgánicos volátiles (COVs) producidos por bacterias, desempeñando un papel esencial en la comunicación planta-microorganismo al modular vías metabólicas y defensivas. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de inducción de resistencia sistémica en plantas de tomate por 10 cepas de Pseudomonas rizosféricas contra Pseudomonas syringae pv. tomate (Pst 338). De estas, las cepas 063, 090 y 093 mostraron reducción de síntomas de peca bacteriana, seleccionando la cepa 090 para continuar el estudio. Se llevaron a cabo ensayos de compuestos orgánicos volátiles a las 24 y 48 horas con el fin de investigar si la producción de estos por parte de la cepa estaba induciendo resistencia en las plantas contra Pst 338. Los resultados indicaron que, efectivamente, la cepa 090 disminuye los síntomas de la peca bacteriana en el intervalo de 48 horas. A continuación, se procedió a evaluar la expresión de los genes PR1a y LOXD, reconocidos como marcadores de los ácidos salicílico (SA) y jasmónico (JA), respectivamente, en dos momentos distintos. En el primer momento, se inoculó la cepa 090 junto con solución salina (S.s) y Acibenzolar-S-metilo (ASM), este último utilizado como control debido a su capacidad para inducir la ruta metabólica del ácido salicílico. En el segundo momento, se evaluó la expresión de estos genes con los mismos tratamientos, pero incluyendo la inoculación de Pst 338. Los resultados obtenidos nos indicaron que la cepa 090 indujo una mayor expresión del gen LOXD, sugiriendo que la ruta de señalización activada por esta cepa es la del ácido jasmónico. Se observó que, cuando las plantas eran inoculadas con Pst 338 en hojas, la expresión predominante fue la del gen PR1a, concluyendo así que el patógeno activa la ruta de señalización del ácido salicílico. De manera similar, tanto la S.s como el ASM sin patógeno también indujeron la expresión del gen PR1a. Estos resultados son cruciales para orientar investigaciones en laboratorios de fitopatología, ofreciendo una mayor comprensión de las posibles rutas de señalización activadas por los microorganismos en la interacción planta-microorganismo (Texto tomado de la fuente).The cultivation of tomatoes stands out worldwide for its economic importance and nutritional value, being essential in Colombian agriculture with a significant production. However, bacterial speck, caused by Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst), threatens yields with damage to leaves and fruits. Despite the common use of agrochemicals, with their negative environmental consequences, strategies such as biological control with rhizospheric fungi and bacteria, especially from the Pseudomonas genus, emerge as sustainable alternatives for disease management by inducing systemic resistance against biotic stresses. Plants, with constitutive defenses and response mechanisms, deploy key responses to threats from herbivores, pathogens, and environmental stress. The induction of resistance in plants is activated by volatile organic compounds (VOCs) produced by bacteria, playing an essential role in plant-microorganism communication by modulating metabolic and defensive pathways. The objective of this work was to evaluate the capacity for systemic resistance induction in tomato plants by 10 rhizospheric Pseudomonas strains against Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst 338). Of these, strains 063, 090, and 093 showed a reduction in bacterial speck symptoms, selecting strain 090 to continue the study. Volatile organic compound assays at 24 and 48 hours were conducted to investigate whether the production of these compounds by the strain was inducing resistance in plants against Pst 338. The results indicated that, indeed, strain 090 decreases the symptoms of bacterial speck within 48 hours. Next, the expression of the PR1a and LOXD genes, recognized as markers of salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA), respectively, was evaluated at two different times. In the first moment, strain 090 was inoculated along with saline solution (S.s) and Acibenzolar-S-methyl (ASM), the later used as control due to its ability to induce the salicylic acid metabolic pathway. In the second moment, the expression of these genes was evaluated with the same treatments, but including the inoculation of Pst 338. The results indicated that strain 090 induced a higher expression of the LOXD gene, suggesting that the signaling pathway activated by this strain is the jasmonic acid pathway. When plants were treated with Pst 338 on leaves , the predominant expression was that of the PR1a gene, concluding that the pathogen activates the salicylic acid signaling pathway. Similarly, both S.s and ASM without pathogen also induced the expression of the PR1a gene. These results are crucial to guide research in phytopathology laboratories, offering a greater understanding of the possible signaling pathways activated by microorganisms in the plant-microorganism interaction.MaestríaMagíster en Ciencias - Microbiología4.1 Selección de aislamientos bacterianos La cepa de Pseudomonas syringae pv. tomate utilizada en este estudio (Pst 338) se obtuvo del banco de -80°C perteneciente al cepario de fitopatología del grupo de Interacciones Moleculares de Microorganismos en Agricultura (LIMMA) de la Universidad de los Andes y es una cepa aislada de cultivos de tomate en Colombia y su genoma ha sido secuenciado (Cai et al, 2011). Esta cepa fue reactivada en agar King´s B (KB) y se llevó a incubadora durante dos días a 28°C. Las cepas de Pseudomonas spp. se obtuvieron del banco de -80°C pertenecientes al cepario de bacterias rizosféricas del Banco de genes y cepas del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN). Estas cepas fueron aisladas de la rizosfera de cultivos de papa de la región Cundiboyacense y habían mostrado en trabajos previos una buena producción de sideróforos y antagonismo in vitro y/o bajo condiciones de invernadero, contra Rhizoctonia solani. Los aislamientos seleccionados fueron: IBUN-Ps 002, -Ps051, -Ps063, -Ps090, -Ps093, -Ps097, -Ps098, -Ps104, -Ps107 y -Ps108. Estas cepas fueron reactivadas en medio Luria Bertani (LB) y se incubaron a 28°C. 4.2 Origen del material vegetal El material vegetal para las pruebas bajo condiciones controladas consistió en plántulas de tomate cultivadas en cuarto de crecimiento en la Universidad de los Andes con temperaturas entre 25 °C y 28 °C; 12 horas de iluminación y 12 horas de oscuridad. Para estas pruebas se emplearon semillas de tomate de la variedad Santa Cruz kada, las cuales fueron sembradas en vasos plásticos de 10 onzas con suelo agrícola sin esterilizar con un contenido de materia orgánica alto (10.26), pH de 5.64 y una conductividad eléctrica de 1.68 no salino. 4.3 Estandarización del proceso de infección de Pseudomonas syringae pv. tomate en plantas de tomate. La cepa de P. syringae pv. tomate fue reactivada en agar KB, fue incubada durante dos días a 28°C. Este mismo día, las plantas a inocular con una semana y media de crecimiento luego de su germinación, fueron colocadas dentro de una cámara húmeda, esto con el fin de estimular la apertura de los estomas en la planta a la hora de realizar la infección. La cámara húmeda se creo mediante una caja de plástico, la cual era pulverizada con agua antes de introducir las plantas y sellarla por completo. Luego de la reactivación de la especie P. syringae se tomaron colonias aisladas de la caja y se sembraron en 25 mL de medio líquido KB; se incubaron a 28°C con 200 rpm por 14-16 horas. La suspensión bacteriana se centrifugo a 7000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante y las bacterias se resuspendieron en aproximadamente 20 mL de 10mM MgCl2. Luego la cepa se llevó a una densidad óptica (OD) 600nm de 1 (equivalente a aproximadamente 3x109 UFC/mL en esta especie) y se diluyó hasta 5 × 108 UFC / mL (esto es equivalente a OD 0,2 para la inoculación por aspersión. La suspensión se vertió en un aerógrafo de marca Gioto Modelo BD138, este aerógrafo se usó para cubrir todas las hojas de una planta de tomate hasta saturación, (cuando las hojas se veían uniformemente mojadas) con al menos 3 hojas verdaderas expandidas. El volumen de saturación en las plantas fue aproximadamente entre 1.5 mL y 2 mL. Se incubaron a 25°C en cuarto de crecimiento con una humedad relativa del 60%-70% y fotoperido de 12 horas luz, 12 horas oscuridad, manteniendo la cámara húmeda por las primeras 24 horas. Posteriormente se removió la cámara húmeda y se continuó con la incubación. Se detectaron síntomas siete días después de la inoculación. Para evaluar la severidad de la enfermedad, se empleó una escala visual que clasificó los síntomas utilizando un índice de enfermedad con un rango de 0 a 3. En esta escala, el nivel 0 indica una planta con apariencia saludable, el nivel 1 denota la presencia de 2 a 5 manchas ya sea agrupadas o dispersas en cada hoja; el nivel 2 implica entre 6 y 10 manchas, mientras que el nivel 3 significa más de 10 manchas, indicando una mayor severidad de la enfermedad (Yunis et al., 1980). Para esta evaluación de la enfermedad se consideraron las manchas en las 3 hojas verdaderas con las cuales contaba la planta en ese momento. 4.4 Inducción de resistencia Para llevar a cabo la inoculación de las Pseudomonas benéficas, se realizó un proceso de desinfección de las semillas de tomate. Inicialmente, las semillas fueron sometidas a un lavado superficial con hipoclorito al 1% durante 5 minutos, seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril. Posteriormente, las semillas se dejaron secar al aire. A continuación, las semillas fueron empapadas individualmente con cada una de las 10 Pseudomonas spp. durante una hora, seguido de otro período de secado al aire. La concentración de cada Pseudomonas spp. se ajustó a un valor de OD de 0,2. Después de una semana, cuando las plantas germinaron y alcanzaron dos o tres hojas verdaderas, se llevó a cabo una segunda inoculación de las Pseudomonas spp. benéficas por drench, aplicando 30 ml de cada una por planta, nuevamente a un OD de 0,2. Siete días después de esta segunda inoculación, se procedió a la inoculación del patógeno, conforme a lo descrito en el numeral 4.3. Finalmente, se evaluaron los síntomas en las plantas por medio de porcentaje de área afectada e índice de la enfermedad según la escala de (Yunis et al., 1980). Cabe destacar que en este experimento se emplearon 10 plantas en cada tratamiento. La evaluación del porcentaje de área afectada se realizó utilizando el programa ImageJ tomando dos hojas por planta; como controles, se incluyeron plantas inoculadas únicamente con solución salina, plantas inoculadas únicamente con el patogeno Pst 338, y plantas inoculadas con un químico conocido como Acibenzolar-S-metilo, reconocido por activar la ruta del ácido salicílico (Buzi et al., 2004). 4.5 Producción de compuestos orgánicos volátiles Después de identificar las cepas de Pseudomonas spp. que mostraron una disminución en el porcentaje de área afectada por los síntomas causados por Pst, se llevó a cabo una evaluación para determinar si esta reducción estaba asociada a la producción de compuestos orgánicos volátiles (COVs). Aqui se evaluaron 2 cepas (090 y 093) Para llevar a cabo la exposición a COVs, se dispuso en el fondo de un recipiente una caja de Petri de 50 milímetros sembrada con cada una de las cepas 24 h antes, esta siembra se realizó por agotamiento; en el extremo superior del recipiente se colocó un vaso plástico de 10 onzas que contenía una plántula de tomate; en total por cada tratamiento se colocaron siete plántulas de tomate que previamente habían sido trasplantadas a vasos de plástico. El espacio entre el recipiente con la bacteria y el vaso con la plántula de tomate, se selló con parafilm para evitar la fuga y dilución de los COVs durante el experimento. Además, se realizaron cinco o seis pequeños orificios en el fondo de los vasos que contenían las plántulas de tomate para exponer las raíces a los COVs. Las plantas fijadas en cada recipiente se colocaron a 25 ° C bajo un fotoperiodo de 12 h de luz / 12 h de oscuridad y se evaluó el tiempo de 24h y 48h de exposición de las plantas a cada una de las Pseudomonas spp. Se utilizo una caja con medio de cultivo sin bacterias como control negativo (Tahir et al., 2017). Posteriormente, se realizó la infección con P. syringae pv. tomate y en cada ensayo se cuantificaron los síntomas por medio de porcentaje de área afectada de acuerdo a la metodología descrita en el numeral 4.4 con el programa Image J; Se compararon los tratamientos (plantas expuestas a COVS) vs. El control (plantas no expuestas a COVs ). 4.6 Determinación de posibles rutas de señalización mediante el uso de marcadores transcripcionales Se empleó la inducción de marcadores asociados a la ruta del ácido salicílico y del ácido jasmónico para esclarecer a través de cuál de estas vías se generó la inducción de resistencia sistémica por parte de las Pseudomonas rizosféricas. En el caso de la ruta del ácido salicílico, se utilizó PR1a, mientras que para el ácido jasmónico se empleó LOXD. Como control, se utilizó ACT (Actina) debido a que su expresión se mantiene constante en diferentes condiciones celulares y ambientales. Para llevar a cabo este análisis, se procedió a evaluar la expresión de los genes mencionados en dos momentos claves del experimento. Se conformaron dos grupos de plantas, cada uno con 4 réplicas biológicas, distribuyendo 4 plantas inoculadas con Ps 090, 4 plantas con Solución salina y 4 plantas con ASM en el primer grupo. Posteriormente, se recolectaron hojas de este grupo después de 24 horas, las cuales fueron maceradas con nitrógeno líquido para llevar a cabo la extracción de ADN. En el segundo grupo, luego de la inoculación con los tratamientos mencionados previamente, 24 horas después se procedió a la inoculación de Pst 338, y nuevamente, 24 horas después, se llevó a cabo la recolección de hojas. Este diseño experimental permitio examinar las respuestas genéticas en dos fases distintas del proceso, proporcionando una visión detallada de la dinámica de expresión génica en el contexto de las interacciones entre las plantas y los tratamientos aplicados. La extracción de ARN se realizó mediante el kit de extracción de ARN Plant RNAeasy de Zymo. Posteriormente, se llevó a cabo la síntesis de cDNA utilizando el kit High capacity cDNA reverse transcription kit de Applied Biosystems. El análisis de qRT-PCR se realizó con el equipo 7500 Fast de Applied Biosystems y el kit Maxima SYBR Green qPCR de Thermofisher. La cuantificación relativa de los transcritos presentes en cada muestra se realizó mediante el método Pfaffl (Pfaff, 2004). Cabe destacar que se emplearon cuatro réplicas biológicas por cada tratamiento. Se comparó la expresión de los genes entre los tratamientos con Pseudomonas rizosférica y aquellos sin la presencia de esta.66 páginasapplication/pdfspaUniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - MicrobiologíaFacultad de CienciasBogotá, ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá500 - Ciencias naturales y matemáticas::507 - Educación, investigación, temas relacionados630 - Agricultura y tecnologías relacionadas::631 - Técnicas específicas, aparatos, equipos, materialesPSEUDOMONAS SYRINGAECYPHOMANDRA BETACEAACIDO SALICILICOMEJORAMIENTO SELECTIVO DE LAS PLANTASINDICE DE SELECCION (MEJORAMIENTO DE LAS PLANTAS)Pseudomonas syringaeCyphomandra betaceaSalicylic acidPlant-breedingSelection indexes (plant breeding)Cultivo del tomatePseudomonas syringae pv. tomatePseudomonas rizosféricasInducción de resistencia sistémicaCompuestos orgánicos volátilesÁcido salicílicoÁcido jasmónicoTomato cultivationRhizospheric PseudomonasSystemic resistance inductionVolatile organic compoundsSalicylic acidJasmonic acidInducción de resistencia sistémica en plantas de tomate contra Pseudomonas syringae pv. tomate por Pseudomonas sppInduction of systemic resistance in tomato plants against Pseudomonas syringae pv. tomato by Pseudomonas sppTrabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TMAbo-Elyousr, K. A. M., Almasoudi, N. M., Abdelmagid, A. W. M., Roberto, S. R., & Youssef, K. (2020). Plant extract treatments induce resistance to bacterial spot by tomato plants for a sustainable system. Horticulturae, 6(2), 1–12. https://doi.org/10.3390/horticulturae6020036Agroproductores. (n.d.). Control Biologico. Retrieved January 29, 2024, from https://agroproductores.com/control-biologico/#:~:text=El%20control%20biol%C3%B3gico%20es%20el%20uso%20de%20t%C3%A9cnicas%2C,el%20impacto%20ambiental%20de%20una%20producci%C3%B3n%20agr%C3%ADcola%20intensiva.Alzandi, A. A., & Naguib, D. M. (2019). Pseudomonas fluorescens metabolites as biopriming agent for systemic resistance induction in tomato against Fusarium wilt. Rhizosphere, 11, 100168. https://doi.org/10.1016/J.RHISPH.2019.100168Ambayeba Muimba-Kankolongo. (2018). 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