Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis

El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno se fundamenta en su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero, sobreviviendo dentro de los macrófagos. En estas células, la micobacteria reside en fagosomas que exhiben una variedad de actividades antimicrobianas como pH ácido, especie...

Full description

Autores:: León Torres, Andrés Felipe

Tipo de recurso:: Doctoral thesis

Fecha de publicación:: 2018

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

Description
Summary:	El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno se fundamenta en su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero, sobreviviendo dentro de los macrófagos. En estas células, la micobacteria reside en fagosomas que exhiben una variedad de actividades antimicrobianas como pH ácido, especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), péptidos antimicrobianos, hidrolasas ácidas, bajo contenido de micronutrientes, y concentraciones no fisiológicas de iones de metales pesados. En este escenario hostil, los transportadores activos de cationes, como las ATPasas tipo P1B, juegan un papel relevante en la homeostasis iónica de la bacteria, al estar relacionados con la desintoxicación de estos metales, y con la respuesta al estrés redox. En el caso de M. tuberculosis, algunas ATPasas tipo P1B se han descrito como factores de virulencia, debido a su papel en la adaptación de la micobacteria al ambiente intracelular. En este orden de ideas, resulta interesante conocer la relación entre la actividad de las ATPasas tipo P1B y las condiciones de estrés que M. tuberculosis soporta durante la infección, con el fin de evaluar el potencial de estos transportadores de membrana en la viabilidad de M. tuberculosis. Para cumplir con este objetivo, el presente trabajo tuvo tres enfoques de estudio diferentes orientados a tener una visión del posible papel de las ATPasas tipo P1B en respuesta a algunas condiciones de estrés que simulan parcialmente el ambiente del fagosoma en el que reside M. tuberculosis. El primero, es el análisis transcripcional de las ATPasas tipo P1B bajo algunas condiciones de estrés al que M. tuberculosis se expone durante la infección. El segundo es la búsqueda de los posibles reguladores transcripcionales de estas ATPasas tipo P1B y la evaluación de su transcripción bajo las mismas condiciones de estrés, para así aproximarse a los potenciales mecanismos de regulación. Finalmente, una aproximación funcional de las tres Cu+ ATPasas putativas de M. tuberculosis, las que representan cerca de la mitad de ATPasas transportadoras de metales pesados en la micobacteria y cuya función se desconoce. Para su análisis se realizó una caracterización funcional de la actividad enzimática de estas tres proteínas, incluyendo análisis bioinformáticos, manipulaciones genéticas y de biología molecular, y finalmente un componente bioquímico para responder a los objetivos propuestos. Se encontró que todas las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis tienen una activación a nivel transcripcional en respuesta a las diferentes condiciones de estrés, como exposición a altas concentraciones de cationes de metales pesados, agentes de estrés oxidativo y nitrosativo, e hipoxia. El análisis transcripcional con cationes de metales pesados mostró que la transcripción de los genes ctpA, ctpG, y ctpV se activa en presencia de Cu2+, ctpC por Zn2+, ctpG por Cd2+ y ctpJ por Co2+. Agentes de estrés oxidativo y nitrosativo activaron la transcripción de los genes ctpA, ctpB, y ctpD, mientras que la hipoxia estimuló la expresión de ctpB y ctpC. Los anteriores resultados muestran que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis se activan con la presencia de cationes de metales pesados, asociándose con el transporte estos metales y en su desintoxicación celular. También se pudo concluir que estas ATPasas se asocian con la respuesta al estrés redox e hipoxia, ayudando a la célula a responder a estas condiciones adversas. Los resultados del análisis transcripcional de los posibles reguladores transcripcionales de las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis, mostraron una respuesta concertada entre la activación de la transcripción del regulador y la ATPasa tipo P1B, lo que significa que los genes de los reguladores transcripcionales propuestos (rv0818, rv2250c, sigC, rv0324, sigH, rv0238, cmtR, nmtR, y csoR) aumentan sus niveles de expresión en respuesta a las mismas condiciones de estrés previamente establecidos para las ATPasas tipo P1B reguladas. Resulta interesante que M. tuberculosis exprese tres Cu+ ATPasas putativas, de las que se desconoce su función biológica. Nuestra hipótesis es que no se trata de sistemas redundantes de extrusión de cobre, sino que se trata de sistemas independientemente controlados que funcionan bajo condiciones metabólicas particulares de la micobacteria. Los análisis funcionales permitieron establecer que, cómo se esperaba, las tres enzimas tienen al Cu+ como sustrato. Los parámetros cinéticos de estas enzimas se determinaron usando ensayos enzimáticos de actividad Cu+ ATPasa y transporte de Cu+, permitiendo establecer que CtpA y CtpB se relacionan con enzimas encargadas de metalar proteínas extracitoplasmáticas, en tanto que CtpV se relaciona con la desintoxicación de Cu+, necesaria cuando los niveles de cobre intracelular sobrepasan el límite requerido y se vuelven deletéreos para la célula. El conjunto de resultados de este trabajo sugiere que las ATPasas tipo P1B de M. tuberculosis juegan un papel importante en la respuesta a las condiciones de estrés que la micobacteria enfrenta durante la infección, incluyendo altas concentraciones de metales pesados, estrés redox y bajas tensiones de oxígeno.

Respuesta de las ATPasas tipo P1B a las condiciones de estrés en Mycobacterium tuberculosis

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