Caracterización de una delta endotoxina mutante de bacillus thuringiensis con estabilidad y toxicidad aumentadas

Título en ingles: Characterization of a Mutant Bacillus thuringiensis d-endotoxin With Enhanced Stability and Toxicity SummaryThe centrally located a-helix 5 of Bacillus thuringiensis d-endotoxins is critical for insect toxicity through ion-channel formation. We analyzed the role of the highly conserved residue Histidine 168 (H168) using molecular biology, electrophysiology and biophysical techniques. Toxin H168R was ~3-fold more toxic than the wild type (wt) protein whereas H168Q was 3 times less toxic against Manduca sexta. Spectroscopic analysis revealed that the H168Q and H168R mutations did not produce gross structural alterations, and that H168R (Tm= 59 °C) was more stable than H168Q (Tm= 57.5 °C) or than the wt (Tm= 56 °C) toxins. These three toxins had similar binding affinities for larval midgut vesicles (Kcom) suggesting that the differences in toxicity did not result from changes in initial receptor binding. Dissociation binding assays and voltage clamping analysis suggest that the reduced toxicity of the H168Q toxin may result from reduced insertion and/or ion channel formation. In contrast, the H168R toxin had a greater inhibition of the short circuit current than the wt toxin and an increased rate of irreversible binding (kobs), consistent with its lower LC50 value.  Molecular modeling analysis suggested that both the H168Q and H168R toxins could form additional hydrogen bonds that could account for their greater thermal stability. In addition to this, it is likely that H168R has an extra positive charge exposed to the surface which could increase its rate of insertion into susceptible membranes. Key words: a-helix 5; Circular dichroism; molecular modeling; site-directed mutagenesis;  thermal stability; Bacillus thuringiensis ResumenLa a-Hélice 5 del domino I de las d-endotoxinas de Bacillus thuringiensis, es crítica para la toxicidad de las toxinas contra insectos al participar en la formación de canales iónicos. La participación en la función tóxica del residuo Histidina 168 (H168) –el cual es altamente conservado– fue estudiada mediante técnicas de biología molecular, electrofisiología y biofísica. La toxina mutante H168R fue ~ 3 veces más tóxica que la toxina silvestre (ts) en Manduca sexta, mientras que H168Q fue 3 veces menos tóxica. Los análisis espectroscópicos indicaron que las mutaciones no producen alteraciones estructurales significativas y que la toxina H168R (Tm= 59 °C) es más estable que las toxinas H168Q (Tm= 57.5 °C) y wt (Tm= 56 °C). Las tres toxinas exhibieron uniones de afinidad similares (Kcom) en vesículas de intestino de larvas de insecto, indicando que las diferencias en la toxicidad no se deben a cambios en la unión inicial al receptor. Los ensayos de unión/disociación y fijación de voltaje mostraron que la reducción de la toxicidad de la toxina H168Q se puede atribuir a una disminución en la inserción y/o en la formación de canales iónicos. De otro lado, H168R mostró una inhibición a la corriente de corto circuito mayor que la ts y un aumento en unión irreversible (kobs), lo cual es consistente con un menor valor de CL50. La modelación molecular sugiere que H168Q y H168R forman puentes de hidrógeno adicionales, lo que les confiere mayor estabilidad térmica. Adicionalmente, es probable que H168R tenga una carga positiva extra expuesta en la superficie, lo cual aumentaría su tasa de inserción en membranas susceptibles.   Palabras clave: a-hélice 5; dicroísmo circular; modelamiento molecular; mutagénesis sitio dirigida; estabilidad térmica; Bacillus thuringiensis

• Autores: Syed Rehan, A. Hussain; Flórez, Álvaro M.; Osorio, Cristina; Dean, Donald H.; Alzate, Óscar
• Tipo de recurso: Article of journal
• Fecha de publicación: 2011
• Institución: Universidad Nacional de Colombia
• Repositorio: Universidad Nacional de Colombia
• Idioma: spa
• OAI Identifier: oai:repositorio.unal.edu.co:unal/39403
• Acceso en línea: https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/39403; http://bdigital.unal.edu.co/29500/; http://bdigital.unal.edu.co/29500/3/
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