Análisis de factores de riesgo para diabetes tipo 2 y obesidad en población colombiana de 40 a 70 años

ilustraciones, gráficas, tablas

Autores:
Riaño Ayala, Ginneth Lorena
Tipo de recurso:
Fecha de publicación:
2022
Institución:
Universidad Nacional de Colombia
Repositorio:
Universidad Nacional de Colombia
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repositorio.unal.edu.co:unal/83003
Acceso en línea:
https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/83003
https://repositorio.unal.edu.co/
Palabra clave:
570 - Biología::572 - Bioquímica
610 - Medicina y salud::616 - Enfermedades
Diabetes Mellitus, Type 2
Risk Factors
Obesity
Diabetes Mellitus Tipo 2
Factores de Riesgo
Obesidad
Diabetes mellitus tipo 2
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Polimorfismos de un solo nucleótido
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spelling Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Calderón Ozuna, Martha Nancy6ff0d7d95b5bd8ae77873027ee62eb7b600Riaño Ayala, Ginneth Lorena010e258860101a87da79fd4cbc4831ffBioquímica y Biología Molecular de las MicobacteriasGinneth Riaño, [0000-0001-9084-6349]2023-01-18T02:35:00Z2023-01-18T02:35:00Z2022https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/83003Universidad Nacional de ColombiaRepositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiahttps://repositorio.unal.edu.co/ilustraciones, gráficas, tablasLa obesidad y la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) son enfermedades representativas de la alteración del metabolismo. Esta investigación comparó factores de riesgo a obesidad y DM2 en colombianos de 40-70 años. Se evaluó la glucosa preprandial y el perfil lipídico a 535 voluntarios; se les aplicó el cuestionario FINDRISC, que incluye información de antecedentes familiares, estilo de vida, composición e índice de masa corporal (IMC); además se analizaron los índices aterogénicos. Las medidas bioquímicas y antropométricas en la población mostraron situaciones de dislipidemias (54%), hiperglucemia (23%), alteración del perímetro de cintura (73%) y del IMC (70%). El FINDRISC valoró que el 57% de la población presentó riesgo entre moderado y alto a DM2. El factor de riesgo genético se evaluó mediante qPCR de alto rendimiento, en 111 voluntarios, e incluyó el análisis de 16 SNPs relacionados con DM2 y 58 SNPs con obesidad; de esos 27 presentaron OR≥1 (relación de probabilidad) como factor de riesgo a obesidad. Se aplicó la puntuación de riesgo genético como predictor de alteración del IMC, con alta sensibilidad y especificidad descritas por el área bajo la curva ROC (AUC=0,9). En promedio la población presentó 62% de riesgo genético a obesidad, sugiriendo los genes LINGO2, NFE2L3, C2orf16, SEC16B, TNEM18, TBX15, APOA5 y BDNF como biomarcadores. El riesgo genético a DM2 en la población fue moderado (64%), en relación directamente proporcional con el IMC. El análisis de biomarcadores a DM2 sugirió a los genes PPARG, WFS1, JAZF1. Evaluar los factores de riesgo favorece la detección y la intervención temprana de las alteraciones metabólicas, en un intento de prevenir las complicaciones, que disminuyen la calidad de vida de la población. (Texto tomado de la fuente).Obesity and type 2 diabetes mellitus (DM2) are representative diseases in the alteration of carbohydrate and lipid metabolism. In this research, we compared risk factors for obesity and DM2 in Colombians aged 40-70 years old. Preprandial glucose and lipid profile were evaluated in 535 volunteers; they were administered the noninvasive FINDRISC questionnaire, which includes information on family history, lifestyle, composition and body mass index (BMI), atherogenic indices were also analyzed. Biochemical and anthropometric measurements in the population showed dyslipidemia (54%), hyperglycemia (23%), altered waist circumference (73%) and BMI (70%). The FINDRISC assessed that 57% of the population presented moderate to high risk of DM2. The genetic risk factor was evaluated by high-throughput qPCR, in 111 volunteers, and included the analysis of 16 SNPs related to DM2 and 58 SNPs associated with obesity; of these 27 presented OR≥1 (odds ratio) as a risk factor for obesity. Genetic risk score was applied as a predictor of BMI alteration, with high sensitivity and specificity described by AUC 0.9 (the area under the ROC curve). On average, the population presented 62% genetic risk to obesity, suggesting the genes LINGO2, NFE2L3, C2orf16, SEC16B, TNEM18, TBX15, APOA5 and BDNF as biomarkers. The genetic risk of DM2 in the population was moderate (64%), in direct proportion to BMI. The analysis of biomarkers to DM2 suggested PPARG, WFS1, JAZF1 genes. Evaluating risk factors favors the detection and early intervention of metabolic alterations, in an attempt to prevent complications, which diminish the quality of life of the population.Esta investigación hace parte del proyecto “Obesidad y Diabetes en Iberoamérica: Factores de riesgo y nuevos biomarcadores patogénicos y predictivos”, financiado por el programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CyTED), y por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Colombia como proyecto de la red IBEROBDIA (918PTE0540). Se desarrolló en el grupo de investigación de Bioquímica y Biología Molecular de Micobacterias (BBMM) del Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia, y el Laboratorio de Higiene Inspección y Control de Alimentos (LHICA). de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Santiago de Compostela (Lugo-España)Incluye anexosMaestríaMagíster en Ciencias - BioquímicaLa metodología desarrollada para el cumplimiento de los objetivos de este estudio de tipo descriptivo, analítico y de corte transversal, involucró el reclutamiento de voluntarios de edad entre 40 y 70 años. A estos hombres y mujeres se les realizó valoración médica junto con pruebas bioquímicas, medidas de composición corporal y antropométricas. Se hizo el análisis de las variantes génicas (SNPs), sobre el ADN de linfocitos de sangre periférica (PBL del inglés Peripheral Blood Lymphocytes) extraído de la sangre de los voluntarios. Reclutamiento de Voluntarios: El reclutamiento de voluntarios permitió obtener las muestras biológicas necesarias para el desarrollo del estudio. Para dar a conocer el proyecto se empleó una estrategia de comunicación que incluyó afiches, plegables y videos, que fueron enviados a la población de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, familiares de pacientes diabéticos de la asociación Colombiana de Diabetes, Juntas de Acción Comunal de localidades y hospitales de diferentes municipios del país entre ellos Cáqueza, La Vega, Usme, Une en el Departamento de Cundinamarca; Circasia en el Quindío, además de las ciudades de Bogotá, Medellín e Ibagué. Por motivos de pandemia no se pudo cumplir con la agenda de incorporar voluntarios de otras ciudades al proyecto. Se realizaron jornadas de salud para atender a los voluntarios por personal médico, bacteriólogos y personal capacitado en toma de medidas antropométricas, de composición corporal y diligenciamiento de encuestas. A todos los voluntarios se les entregó un documento que contenía la información del proyecto, el consentimiento informado que permitía la toma de muestras biológicas y su análisis, además del tratamiento de datos según la ley 1581 de 2012. En este documento se le indicaba al voluntario que tenía la libertad de abandonar el estudio en cualquier momento (Anexo II). Para iniciar el proceso cada voluntario debía firmar el consentimiento informado, el cual quedó en poder del grupo de investigación; a cada documento se le asignó un código numérico como parte de la identificación de las muestras y la protección de datos. Criterios de inclusión: Todos los voluntarios debían ser de nacionalidad colombiana, además de cumplir con los siguientes criterios de inclusión (i) estar dentro del rango de edad de 40 a 70 años; (ii) no tener diagnóstico de diabetes y/o no estar tomando medicación para esta patología; (iii) no estar tomando medicación para la hipertensión arterial (HTA), y/o fármacos que puedan alterar la capacidad mental o de alerta; (iv) no estar en estado de embarazo, y (v) estar en ayuno alrededor de 8 horas. Criterios de exclusión: Se excluyeron voluntarios menores o mayores al rango de edad (40-70 años), con diagnóstico de diabetes. También mujeres en estado de embarazo, voluntarios que estuvieran ingiriendo medicamentos para DM2 y sustancias psicoactivas; personas con discapacidad mental, y todos aquellos que no estaban en ayunas. Protocolo de reclutamiento: Luego de firmar el consentimiento informado cada voluntario pasaba a la valoración médica que incluyó, (i) la medida de la tensión arterial (tensiómetro Welch Allyn); (ii) la talla (el tallímetro-estadímetro portátil SECA modelo 213); (iii) el perímetro de cintura se midió entre el borde inferior de la décima costilla y el borde superior de la cresta ilíaca en espiración, el procedimiento se realizaba después de una espiración normal con una cinta métrica plástica con una precisión de 1mm (LORD) LDC-338; (iv) diligenciamiento de la historia clínica; (v) glucometría en ayunas (glucómetro Roche y kit Accu-chek). Las medidas de composición corporal y bioimpedancia se realizaron en una balanza Omron modelo Hbf-514c (healthcare, inc USA). Luego de ser calibrado el equipo, a cada voluntario se le solicitó el retiro de calcetines, y elementos metálicos, colocando los pies sobre los electrodos de la balanza, en posición erguida con mirada al frente y empuñando los electrodos para cerrar el circuito. En el formulario se diligenciaron los valores de masa corporal (Kg), IMC (Kg/m2), porcentajes de grasa corporal total, grasa visceral y musculo. Con los datos correspondientes se diligenció el cuestionario FINDRISC (Anexo III), que luego de la valoración permitió discriminar entre aquellos voluntarios a los que se les realizaría la PTOG (puntaje mayor a 12, con riesgo del 17% a padecer DM2 en 10 años). A los voluntarios se les tomó muestra de sangre para las pruebas bioquímicas del análisis metabólico y para extracción de ADN. El universo de la población reclutada fue 620 mujeres y hombres colombianos, de estos quienes completaron el protocolo básico fueron 535. Se seleccionaron 111 para el análisis de las variantes génicas (SNP) de acuerdo con las características de FINDRISC, antecedentes familiares de DM2, e IMC. Toma de muestra sanguínea: La extracción de la muestra de sangre se realizó por punción venosa, aproximadamente 10 mL en tubo seco y 5 ml en tubo con anticoagulante (EDTA). Las muestras se centrifugaron por 10 minutos a 1600 xɡ. se hizo la separación del sobrenadante suero o plasma y la fracción enriquecida en linfocitos de sangre periférica (PBLs). Las fracciones se almacenaron a -70°C, en alícuotas de 500 µL para su posterior uso. Análisis bioquímicos :Las pruebas bioquímicas se determinaron utilizando la metodología enzimática-colorimétrico con detección espectrofotométrica a 505 nm siguiendo el protocolo y uso de kits de la marca SPINREACT. Se determinó cuantitativamente en mg/dL la glucosa (pre y poscarga según correspondía), triglicéridos (TG), colesterol total (CT), colesterol HDL (cHDL). Los valores de colesterol LDL (cLDL) se determinaron mediante la fórmula de Friedewald que indica que esta lipoproteína es igual al resultado proveniente de sumar el c-HDL con el c-VLDL y ese valor restarlo del CT, [c-LDL = CT-(c-HDL+c-VLDL)]. [90], el cálculo de colesterol VLDL (cVLDL) se realizó dividiendo el valor de TG entre 5. Extracción de ADN de las muestras sanguíneas: La fracción celular de glóbulos blancos se sometió a extracción de ADN, mediante el kit Purelink Genomic (Invitrogen de Thermo Fisher Scientific, Inc Alemania). En la optimización del proceso de extracción para aumentar la concentración y calidad del DNA, se hicieron algunas modificaciones al protocolo recomendado por el fabricante. En un tubo estéril de 2,0 mL se adicionaron por cada 600 µL de la fracción de sangre enriquecida en los glóbulos blancos, 1200 µL buffer de lisis (160 mM NH4Cl – 20 mM NaHCO3), se homogenizó por inversión y se realizó un pulso de centrifuga. Se descartó el sobrenadante y al pellet se le adicionó 20 µL de proteinasa K (20 mg/mL), además de 20 µL de RNasa (20 mg/mL) y se homogenizó con vortex suave; el lisado se incubó a temperatura ambiente por 2 minutos. Se adicionó 20µL de SDS y 100µL de CTAB 2%, se homogenizó e incubó a 55°C por 12 minutos. Se adicionó 250 µL de buffer de unión que contenía cloruro de guanidinio (CH5N3.HCl saturado - 10 mM Tris-HCl pH 8,0 - 500mM EDTA), se homogenizó e incubó por 5 minutos. Por cada 300 µL de la muestra anterior, se adicionaron 100µL de acetato de amonio 10M y 400 µL de isopropanol; se homogenizó con vortex suave, y el sobrenadante traslucido se transfirió a la columna de sílica, ensamblada a un tubo de recolección. Se centrifugó a 9000 xɡ por un minuto a temperatura ambiente, se descartó el filtrado. La columna de sílica-ADN fue lavada dos veces por centrifugación con 400µl del buffer de lavado (3 M CH5N3.HCl en etanol 70%). Se lavó dos veces más con 500 µL de etanol 70%, y el último lavado se centrifugó a 10000 xg por 3 minutos a temperatura ambiente, para garantizar la eliminación del etanol. Para la elución del ADN, la columna se ensambló a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL y se adicionó 100 µL de buffer de elución (10mM Tris - 1mM EDTA pH 8), se incubó a temperatura ambiente por cinco minutos y se centrifugó la columna a 10000 xg por 1 minuto. Se evaluó la concentración y pureza del ADN teniendo en cuenta la relación de absorbancia 260/280nm y 260/230nm, mediante espectrofotometría UV-Vis (Nanodrop OneC Thermo Fisher Scientific) y espectroscopia de fluorescencia (Qubit y kit 1X dsDNA High Sensitivity - Thermo Fisher Scientific). El ADN se almacenó a -20°C hasta su uso. Amplificación de SNPs mediante qPCR de alto rendimiento: Se realizó el análisis de SNPs asociados a obesidad y DM2 al ADN extraído de linfocitos de sangre periférica (PBLs) de 111 voluntarios. En la selección se tuvo en cuenta aquellos que cumplieron los criterios de inclusión y completaron todo el protocolo de reclutamiento, especialmente con antecedentes familiares de DM2, FINDRISC mayor a 12, sobrepeso y obesidad. El perfil genotípico de cada ADN proveniente de los PBLs de los voluntarios se realizó mediante PCR cuantitativa de alto rendimiento. Para el análisis de las variantes génicas asociadas a riesgo de obesidad se utilizó la tecnología TaqMan® OpenArray® (Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific). Con los fluoróforo VIC (alelo 1) y FAM (alelo 2) se marcaron las sondas TaqMan® diseñadas para cada uno de los SNPs. Estos fueron precargados en placas de Openarray® por la empresa ThermoFisher Scientific. Las placas de Openarray® están compuestas por 3072 pozos divididos en 48 subarreglos de 64 pozos cada uno. Se cargaron en el Openarray 111 muestras de ADN, este proceso está robotizado dado lo complejo del sistema e ínfimo de los volúmenes aplicados (nL). Cada muestra fue sometida al análisis de 58 SNPs . Las reacciones de PCR se realizaron según el protocolo TaqMan® OpenArray® del fabricante . De forma resumida, en la placa de PCR de 384 pozos, se adicionaron volúmenes iguales (2,5 µL) de la muestra de ADN y el buffer de TaqMan® OpenArray® Genotyping PCR Master Mix (Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific). Cada mezcla de reacción de PCR fue cargada automáticamente en las placas OpenArray®, utilizando el sistema OpenArray® AccuFill™ (Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific). Ese proceso garantiza 33 nL en cada uno de los 3072 pozos de la placa de OpenArray®. La placa fue sellada e inmersa en aceite para evitar la evaporación de las muestras; ésta se ensambló en el equipo de qPCR QuantStudio 12K Flex para el proceso de amplificación con el siguiente protocolo (i) ciclo Pre-PCR de 10 min a 93ºC (ii) 50 ciclos con la siguiente programación 95 °C por 45 s, 94ºC por 13 s y 53,5°C por 120 s. Finalizada la reacción de qPCR, los datos del ensayo OpenArray® fueron procesados en el software Cloud online (Thermo Fisher Scientific). El software asigna automáticamente los alelos según los valores de fluorescencia generados por cada sonda TaqmanTM. Los resultados se muestran en forma de gráfico de discriminación donde cada punto corresponde con una muestra. Las muestras homocigotas emiten fluorescencia de una única sonda y son visualizadas sobre los ejes X o Y según corresponda. Para las muestras de individuos heterocigotos la fluorescencia proviene de dos sondas (una por cada alelo) que es visualizado en medio de las coordenadas. En general, el software asignó automáticamente los SNPs, sin embargo, existieron algunos que debieron ser asignados manualmente, de acuerdo con la característica del gráfico de discriminación alélica. El software permite exportar los resultados a la hoja de cálculo de Microsoft Excel (Microsoft Office, WA, USA). Con estos datos se inició el cálculo de los parámetros para determinar el riesgo genético; entre ellos la frecuencia alélica, la frecuencia genotípica, la relación de probabilidades (OR), la puntación de riesgo genético y por último el porcentaje global del riesgo genético para el desarrollo de obesidad y diabetes. Para el análisis de las variantes génicas asociadas a riesgo de DM2 las muestras de ADN fueron diluidas a la mitad de su concentración y enviadas a la empresa “Patia diabetes”. Ellos desarrollaron el Test Genético “Diabetes Prevent”, siendo la primera prueba patentada para detectar el riesgo genético a padecer DM2 . Como parte del convenio con el LHICA, la empresa Patia presta el servicio de procesamiento y análisis de los SNPs asociados a DM2. El Test Diabetes Prevent contiene la matriz para el análisis de 16 variantes génicas (SLC16A11, INS-IGF2, HNF1A, WFS1, SLC30A8, PPARG, IGF2BP2, CDKAL1, ADCY5, JAZF1, HHEX/IDE, KCNJ11, KCNQ1, TCF7L2, FTO, CDKN2A/B) Análisis Estadístico: Los datos básicos y los resultados de las pruebas bioquímicas obtenidos de las muestras de suero de los voluntarios fueron analizados estadísticamente en el Software STATGRAPHICS Centurión XVI. La distribución se determinó variable a variable, el IMC y su discriminación en normopeso (NP), sobrepeso (SP) y obesidad (OB) fue la variable con la que se contrastaron las demás. Se aplicó la prueba de Kolmogórov-Smirnov para determinar la normalidad de los datos Se calculó el valor de p mediante el test de análisis de varianza ANOVA para variables con distribución normal, y el test de Kruskal Wallis para las variables con una distribución no normal. El cálculo de p permitió determinar las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Se asignó el rango para p ≤ 0.05 en un intervalo de confianza ≥ del 95% . Se usó el programa Graphpad Prism 9 (Graphpad, Estados Unidos) para el análisis de variantes génicas de riesgo a diabetes y obesidad. Para cada uno de los grupos estudiados, la frecuencia alélica de cada SNP se calculó dividiendo el número de uno de los dos tipos de alelos entre el número total de alelos de la muestra. Para calcular la frecuencia de cada genotipo en cada SNP, se dividió el número de genotipos de cada tipo entre en el número total de genotipos para ese SNP. Se utilizó la prueba estadística de Χ2 de Pearson para analizar el equilibrio de Hardy-Weinberg. Para determinar la asociación entre los alelos de riesgo y la población estudiada, (normopeso, sobrepeso y obesidad), se realizó una prueba χ2 para determinar los Odds Ratio (O.R.). Se utilizó el test de Fisher para calcular el valor p, y también para determinar la influencia de los genotipos en el desarrollo de obesidad. Un valor de O.R mayor a 1 indica una relación positiva entre el alelo de riesgo y el desarrollo de obesidad. Cuando el valor de O.R. es menor de 1, no hay relación entre el alelo de riesgo y la obesidad. La puntuación de riesgo genético (PRG) resulta de la sumatoria de la relación de cada OR con su SNP multiplicado por el número de eventos y dividido en la sumatoria de los OR positivos para el riesgo . PRG=(OR1 x SNP1+OR2 x SNP2+⋯+ORn x SNPn)x (n/(∑ORs)) Para el cálculo final del PRG se asignó un código numérico a cada uno de los genotipos. A los individuos que no presentaron alelo de riesgo se les asignó el código 1. Quienes tuvieron un alelo de riesgo se codificaron con el número 2, y para aquellos individuos que portaron los dos alelos de riesgo se les asignó el código 3. Con el fin de asociar las variantes génicas de riesgo a obesidad con el IMC, se calculó un PRG con los SNPs que presentaron un O.R. mayor a 1, para cada grupo de discriminación normopeso (NP), sobrepeso (SP) y obesidad (OB). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor, para determinar las diferencias significativas de PRG entre los diferentes grupos de estudio. La valoración de la sensibilidad y la especificidad de la fórmula PRG para cada grupo fue analizada mediante la curva ROC.  Bioquímica y biología molecular95 páginasapplication/pdfspaUniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - BioquímicaFacultad de CienciasBogotá, ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá570 - Biología::572 - Bioquímica610 - Medicina y salud::616 - EnfermedadesDiabetes Mellitus, Type 2Risk FactorsObesityDiabetes Mellitus Tipo 2Factores de RiesgoObesidadDiabetes mellitus tipo 2ObesidadFINDRISCÍndices aterogénicosPolimorfismos de un solo nucleótidoFactores de riesgo genéticoType 2 diabetesObesityFINDRISCAtherogenic indexSingle nucleotide polymorphismsGenetic risk factorsAnálisis de factores de riesgo para diabetes tipo 2 y obesidad en población colombiana de 40 a 70 añosAnalysis of risk factors for type 2 diabetes and obesity in a Colombian population between 40 and 70 years oldTrabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TMBireme“Enfermedades no transmisibles,” 2021. 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