Caracterización funcional de un canal de cloruro CLC de Leishmania

Leishmania spp., abarca organismos unicelulares eucariota con un ciclo de vida caracterizado por dos grandes estadíos (promastigote y amastigote) expuestos a diferencias de pH, osmolaridad y temperatura. Dados estos cambios, se espera que el parásito desarrolle mecanismos regulatorios para su superv...

Full description

Autores:: Garcia Otalora, Michel Andrés

Tipo de recurso:: Doctoral thesis

Fecha de publicación:: 2016

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

Description
Summary:	Leishmania spp., abarca organismos unicelulares eucariota con un ciclo de vida caracterizado por dos grandes estadíos (promastigote y amastigote) expuestos a diferencias de pH, osmolaridad y temperatura. Dados estos cambios, se espera que el parásito desarrolle mecanismos regulatorios para su supervivencia. Estudios previos en promastigotes han descrito bombas H+ ATPasas que generan un gradiente electroquímico útil para el transporte secundario de nutrientes (Zilberstein and Shapira, 1994), y que están acopladas a transportadores aniónicos (Vieira, Slotki, and Cabantchik, 1995; Vieira, Lavan, Dagger, and Cabantchik, 1994). Hasta el momento, se conoce poco respecto a la naturaleza molecular o al papel que desempeñan éstas moléculas en la fisiología de Leishmania spp., pero se ha observado que su inhibición, altera transporte de aminoácidos, volumen celular (Vieira, Lafuente, Gamarro, and Cabantchik, 1996), pH intracelular (Vieira et al., 1994), y potencial de membrana (Vieira et al., 1995). Para iniciar el estudio de transportadores aniónicos en Leishmania el grupo de Biofísica y biología de membranas registró corrientes rectificadoras de salida, voltaje y Cl- dependientes, inhibidas por ácido 4,4'- diisotiocianostilbeno- 2,2'-disulfónico (DIDS), luego de la microinyección de mRNA total poliadenilado de promastigotes estacionarios de L. L. amazonensis (Lagos, Moran, and Camacho, 2007) y L. V. braziliensis (Garzón, Stühmer, and Camacho, 2009) en ovocitos de Xenopus laevis. Estas corrientes tienen características electrofisiológicas de canales de cloruro voltaje dependientes o CLC (por sus siglas en inglés). Así, se exploró el genoma de L. V. braziliensis encontrando cuatro secuencias codificantes para canales de cloruro que eran CLC putativas (Quintero, 2014; Parada, 2014; Carreño, 2015). La expresión ha sido verificada para tres de estos genes en promastigotes y para todos ellos en amastigotes in situ de L. V. braziliensis (Carreño, 2015). A la fecha LbCLC-A, LbCLC-B y LbCLC-C han sido clonados (Lozano Jiménez, 2012; Quintero, 2014; Parada, 2014). Este trabajo se enfoca en la caracterización funcional de LbCLC-B. Esta proteína se detecta en estructuras puntiformes intracelulares en promastigotes de L. V. braziliensis. LbCLC-B posee localización diferencial respecto a LbCLC-A y LbCLC-C en promastigotes. Marcajes dobles (golgina 97-LbCLC-B) indican co- localización parcial con el Complejo de Golgi. Su patrón de expresión difiere dependiendo de la etapa del parásito, siendo puntiforme localizado perinuclear y perikinetoplástico en promastigotes en división e inmaduros, para volverse puntiforme distribuido en todo el citoplasma en promastigotes maduros. Se sugiere además que LbCLC-B es reclutada durante lesión celular por daño osmótico. Inyección de cRNA LbCLC-B en ovocitos de X. laevis altera su volumen. Registros electrofisiológicos de voltage clamp con dos electrodos 48 horas post-inyección muestran corrientes rectificadoras de salida, voltaje dependientes que se incrementan a pH 5 y cuyo potencial de reversión es sub- nernstiano sugestivo de actividad como intercambiador. Se encontró evidencia de la participación de LbCLC-B en la regulación del volumen en promastigotes de Leishmania mediante ensayos de interferencia en la expresión. Se escogieron dos líneas de parásitos que presentaban alteraciones en el patrón de expresión de α-tubulina. En una de estas líneas se encontró una disminución regulatoria del volumen inducida en medio hipotónico sugestivo de interferencia. Con base en los hallazgos se propone que LbCLC-B estaría involucrado en la regulación del volumen.

Caracterización funcional de un canal de cloruro CLC de Leishmania

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