Expresión y caracterización funcional de una ADN polimerasa I de Geobacillus stearothermophilus
La ADN polimerasa de Geobacillus stearothermophilus (ADN Pol I Bst), es un miembro de la familia A de las polimerasas, que posee características desplazamiento de hebra que favorecen su aplicación en métodos de amplificación isotérmica. En el presente trabajo se describe la expresión y caracterizaci...
- Autores:
-
Estupiñan Molina, Cristian David
- Tipo de recurso:
- Fecha de publicación:
- 2024
- Institución:
- Universidad Nacional de Colombia
- Repositorio:
- Universidad Nacional de Colombia
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.unal.edu.co:unal/86461
- Palabra clave:
- 540 - Química y ciencias afines
610 - Medicina y salud::616 - Enfermedades
570 - Biología::572 - Bioquímica
ADN Polimerasa I
Polimerasa Taq
Virus de la Mieloblastosis Aviar
Coronavirus
Prueba de COVID-19
DNA Polymerase I
Taq Polymerase
Avian Myeloblastosis Virus
COVID-19 Testing
Geobacillus stearothermophilus
Polimerasa
ADN Pol I Bst
Pol Bst
LAMP
SARS-CoV-2
Polyerase
Pol I Bst DNA
- Rights
- openAccess
- License
- Reconocimiento 4.0 Internacional
| Summary: | La ADN polimerasa de Geobacillus stearothermophilus (ADN Pol I Bst), es un miembro de la familia A de las polimerasas, que posee características desplazamiento de hebra que favorecen su aplicación en métodos de amplificación isotérmica. En el presente trabajo se describe la expresión y caracterización funcional de una ADN Pol I Bst, iniciando por la secuenciación del plásmido mediante tecnología Oxford Nanopore, para confirmar la secuencia codificante de la proteína, seguido de un análisis in sillico, con el propósito de determinar la estructura 3D y sitios activos de la proteína. Posteriormente, se realizó la expresión, extracción, purificación, determinación de la actividad catalítica y análisis de funcionalidad mediante Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) a 65 °C por 60 min, utilizando cómo sustrato ARN de SARS-CoV-2. Los resultados reflejan una secuencia codificante de 576 aminoácidos que pertenece al fragmento grande de ADN Pol I Bst, el cual tiene peso molecular de 61,8 kDa. Se obtuvo una concentración de 2mg/ml de proteína total, que posee una actividad enzimática de 606.4 U y una actividad especifica de 3.0×105 U/mg. Finalmente, se demuestra que la proteína es funcional al amplificar una secuencia perteneciente al Orf1a de ARN de SARS-CoV-2. Aquí se presenta una proteína funcional, con libertad de operación para su distribución y que es aplicable a sistemas de amplificación isotérmica para el diagnóstico de enfermedades de importancia clínica (Texto tomado de la fuente). |
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