Cuantificación de la expresión del canal de cloruro Lbrm01_v2.0210 y de los canales CLC putativos Lbrm32v2.3670, Lbrm33_v2.1260 y Lbrm04_v2.1010 en promastigotes y amastigotes de L.braziliensis (2015)
Leishmania es un parásito que genera enfermedades en mamíferos incluyendo humanos conocidas como Leishmaniosis, las cuales pueden llegar a ser fatales y representan un problema de salud pública en Colombia. Durante su ciclo de vida el parásito habita en dos hospederos, el primero es un díptero, donde el parásito está expuesto a pH de 7,0-9,0, temperatura de 25°C y osmolaridad 300 mOsm; el otro hospedero son células mononucleares mamíferas. En éstas habita un compartimiento intracelular (vacuola parasitófora) y experimenta pH ácido 4,5 -5,0, temperatura de ~35-37°C y osmolaridad sugerida de 150 – 250 mOsm. Debido a este cambio de condiciones el parásito pasa de ser promastigote flagelado en el insecto, a amastigote aflagelado en el mamífero manteniendo pH intracelular cercano a neutro, por la alta capacidad tampón de su citoplasma. Esta habilidad de regular pH está relacionada con la función de una bomba protón ATPasa cuya actividad depende de canales de aniónicos. El Grupo de Biofísica y Biología de Membranas registró corrientes de cloruro en ovocitos de Xenopus laevis tras la inyección de ARNm de Leishmania amazonensis y Leishmania braziliensis. Estas corrientes podrían ser el resultado de la actividad de canales/intercambiadores CLC. Por tanto se buscaron canales de cloruro en el genoma de L. braziliensis, encontrándose cuatro genes putativos Lbrm01_v2.0210 (LbCLCA), Lbrm32v2.3670 (LbCLCB), Lbrm33_v2.1260 (LbCLCc) y Lbrm04_v2.1010 (LbCLCD). Las 4 secuencias encontradas codificarían proteínas CLC. LbCLCA, LbCLCB y LbCLCc se transcriben en promastigotes y amastigotes axéncios. En este trabajo se propuso confirmar los hallazgos de transcripción de estos genes en los estadios mencionados y ampliarla mediante la determinación de la expresión de estos CLC durante el ciclo in vitro del parásito. Así mismo cuantificar su expresión génica a nivel de ARNm por RTqPCR absoluta. Para esto se estableció la infección de una línea celular de macrófagos de ratón con L. braziliensis y se siguió a diferentes tiempos. Se obtuvo ARN total que sirvió de plantilla para la síntesis de ADNc que fue amplificado con primers específicos diseñados para cada uno de los genes. Se confirmó la transcripción de LbCLCA, LbCLCB y LbCLCc en promastigotes y amastigotes axéncios así como se reporta por primera vez la transcripción en tiempos tempranos post-infección y amastigotes in situ. Para LbCLCD no se detectaron transcritos en promastigote en estado estacionario cultivado in vitro pero sí en tiempos tempranos post-infección y amastigotes in situ indicando regulación diferencial de este gen en estadios diferentes de Leishmania. A partir de ADNc de promastigote se clonaron productos de ~200 nt de LbCLCA, LbCLCB y LbCLCC para PCR en tiempo real. Se lograron curvas estándar de cuantificación para LbCLCA y LbCLCC, dando como resultado que la expresión de estos genes es mayor durante la primera hora post-infección. En este tiempo el parásito en estadio promastigote estacionario es enfrentando a cambios drásticos de pH, temperatura y quizás osmolaridad que parecen disparar la transcripción de estos dos genes y podrían ser importantes para el proceso de transformación de promatigote a amastigote.