MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral
ilustraciones, diagramas, tablas
- Autores:
-
Cruz Romero, Sergio Danilo
- Tipo de recurso:
- Fecha de publicación:
- 2024
- Institución:
- Universidad Nacional de Colombia
- Repositorio:
- Universidad Nacional de Colombia
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.unal.edu.co:unal/87061
- Palabra clave:
- 610 - Medicina y salud::617 - Cirugía, medicina regional, odontología, oftalmología, otología, audiología
610 - Medicina y salud::616 - Enfermedades
Carcinoma de Células Escamosas
Carcinoma, Squamous Cell
Neoplasias
Neoplasms
Metaloproteinasas de la Matriz
Matrix Metalloproteinases
Biomarcadores de Tumor
Biomarkers, Tumor
Carcinoma escamocelular de la cavidad oral
Metaloproteinasas de matriz
Inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2
Saliva
Oral cavity squamous cell carcinoma
Matrix metalloproteinases
Tissue inhibitor of metalloproteinase-2
- Rights
- openAccess
- License
- Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional
| id |
UNACIONAL2_0f44a5bda69addd4f060d94660e38c9a |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.unal.edu.co:unal/87061 |
| network_acronym_str |
UNACIONAL2 |
| network_name_str |
Universidad Nacional de Colombia |
| repository_id_str |
|
| dc.title.spa.fl_str_mv |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral |
| dc.title.translated.eng.fl_str_mv |
Salivary and tissue MMP-2, MMP-9, and TIMP-2 as diagnostic and prognostic biomarkers in oral squamous cell carcinoma |
| title |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral |
| spellingShingle |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral 610 - Medicina y salud::617 - Cirugía, medicina regional, odontología, oftalmología, otología, audiología 610 - Medicina y salud::616 - Enfermedades Carcinoma de Células Escamosas Carcinoma, Squamous Cell Neoplasias Neoplasms Metaloproteinasas de la Matriz Matrix Metalloproteinases Biomarcadores de Tumor Biomarkers, Tumor Carcinoma escamocelular de la cavidad oral Metaloproteinasas de matriz Inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 Saliva Oral cavity squamous cell carcinoma Matrix metalloproteinases Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 |
| title_short |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral |
| title_full |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral |
| title_fullStr |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral |
| title_full_unstemmed |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral |
| title_sort |
MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oral |
| dc.creator.fl_str_mv |
Cruz Romero, Sergio Danilo |
| dc.contributor.advisor.spa.fl_str_mv |
Baldión Elorza, Paula Alejandra Rodríguez-Urrego, Paula A. |
| dc.contributor.author.spa.fl_str_mv |
Cruz Romero, Sergio Danilo |
| dc.contributor.researchgroup.spa.fl_str_mv |
Invendo Departamento de Patologia Fsfb Universidad de los Andes Enfermedades Complejas |
| dc.contributor.orcid.spa.fl_str_mv |
Cruz Romero, Sergio Danilo [0000-0001-9472-7515] |
| dc.subject.ddc.spa.fl_str_mv |
610 - Medicina y salud::617 - Cirugía, medicina regional, odontología, oftalmología, otología, audiología 610 - Medicina y salud::616 - Enfermedades |
| topic |
610 - Medicina y salud::617 - Cirugía, medicina regional, odontología, oftalmología, otología, audiología 610 - Medicina y salud::616 - Enfermedades Carcinoma de Células Escamosas Carcinoma, Squamous Cell Neoplasias Neoplasms Metaloproteinasas de la Matriz Matrix Metalloproteinases Biomarcadores de Tumor Biomarkers, Tumor Carcinoma escamocelular de la cavidad oral Metaloproteinasas de matriz Inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 Saliva Oral cavity squamous cell carcinoma Matrix metalloproteinases Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 |
| dc.subject.decs.none.fl_str_mv |
Carcinoma de Células Escamosas Carcinoma, Squamous Cell Neoplasias Neoplasms Metaloproteinasas de la Matriz Matrix Metalloproteinases Biomarcadores de Tumor Biomarkers, Tumor |
| dc.subject.proposal.spa.fl_str_mv |
Carcinoma escamocelular de la cavidad oral Metaloproteinasas de matriz Inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 Saliva |
| dc.subject.proposal.eng.fl_str_mv |
Oral cavity squamous cell carcinoma Matrix metalloproteinases Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 |
| description |
ilustraciones, diagramas, tablas |
| publishDate |
2024 |
| dc.date.accessioned.none.fl_str_mv |
2024-10-25T13:56:32Z |
| dc.date.available.none.fl_str_mv |
2024-10-25T13:56:32Z |
| dc.date.issued.none.fl_str_mv |
2024 |
| dc.type.spa.fl_str_mv |
Trabajo de grado - Maestría |
| dc.type.driver.spa.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| dc.type.version.spa.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| dc.type.content.spa.fl_str_mv |
Text |
| dc.type.redcol.spa.fl_str_mv |
http://purl.org/redcol/resource_type/TM |
| status_str |
acceptedVersion |
| dc.identifier.uri.none.fl_str_mv |
https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/87061 |
| dc.identifier.instname.spa.fl_str_mv |
Universidad Nacional de Colombia |
| dc.identifier.reponame.spa.fl_str_mv |
Repositorio Institucional Universidad Nacional de Colombia |
| dc.identifier.repourl.spa.fl_str_mv |
https://repositorio.unal.edu.co/ |
| url |
https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/87061 https://repositorio.unal.edu.co/ |
| identifier_str_mv |
Universidad Nacional de Colombia Repositorio Institucional Universidad Nacional de Colombia |
| dc.language.iso.spa.fl_str_mv |
spa |
| language |
spa |
| dc.relation.references.spa.fl_str_mv |
1. Panarese I, Aquino G, Ronchi A, Longo F, Montella M, Cozzolino I, et al. Oral and Oropharyngeal squamous cell carcinoma: prognostic and predictive parameters in the etiopathogenetic route. Expert Review of Anticancer Therapy 2019; https://doi.org/10.1080/14737140.2019.1561288 19: 105–19 2. Johnson DE, Burtness B, Leemans CR, Lui VWY, Bauman JE, Grandis JR. Head and neck squamous cell carcinoma. Nat Rev Dis Primers 2020;6:92. https://doi.org/10.1038/s41572-020-00224-3. 3. Aupérin A. Epidemiology of head and neck cancers: an update. Curr Opin Oncol. 2020 May;32(3):178-186. https://doi.org/10.1097/CCO.0000000000000629. 4. Chamoli A, Gosavi AS, Shirwadkar UP, Wangdale KV, Behera SK, Kurrey NK, et al. Overview of oral cavity squamous cell carcinoma: Risk factors, mechanisms, and diagnostics. Oral Oncology 2021; 121: 105451. https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2021.105451 5. Ciccone L, Vandooren J, Nencetti S, Orlandini E. Natural marine and terrestrial compounds as modulators of Matrix Metalloproteinases-2 (MMP-2) and MMP-9 in Alzheimer’s disease. Pharmaceuticals 2021; 14: 86. https://doi.org/10.3390/ph14020086 6. 6. Nishio K, Motozawa K, Omagari D, Gojoubori T, Ikeda T, Asano M, et al. Comparison of MMP-2 and MMP-9 expression levels between primary and metastatic regions of oral squamous cell carcinoma. Journal of Oral Science 2016; 58: 59–65. https://doi.org/10.2334/josnusd.58.59 7. 7. Smriti K, Ray M, Chatterjee T, Shenoy R-P, Gadicherla S, Pentapati K-C, et al. Salivary MMP-9 as a biomarker for the diagnosis of oral potentially malignant disorders and oral squamous cell carcinoma. Asian Pac J Cancer Prev 2020; 21: 233–8. https://doi.org/10.31557/APJCP.2020.21.1.233 8. 8. Stamenkovic I. Extracellular matrix remodelling: the role of matrix metalloproteinases. The Journal of Pathology 2003;200:448–64. https://doi.org/10.1002/path.1400. 9. Gialeli C, Theocharis AD, Karamanos NK. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. The FEBS Journal 2011;278:16–27. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2010.07919.x. 10. Rosenthal EL, Matrisian LM. Matrix metalloproteases in head and neck cancer. Head & Neck 2006;28:639–48. https://doi.org/10.1002/hed.20365. 11. Patil R, Mahajan A, Pradeep G, Prakash N, Patil S, Khan S. Expression of matrix metalloproteinase-9 in histological grades of oral squamous cell carcinoma: An immunohistochemical study. J Oral Maxillofac Pathol 2021;25:239. https://doi.org/10.4103/0973-029X.325121. 12. Benitha G, Ramani P, Jayaraman S, R A, Ramalingam K, Krishnan M. Evaluation of Serum Levels of Matrix MetalloProteinase-9 (MMP-9) in Oral Squamous Cell Carcinoma and Its Clinicopathological Correlation. Cureus 2023. https://doi.org/10.7759/cureus.34954. 13. Hema Shree K, Ramani P, Sherlin H, Sukumaran G, Jeyaraj G, Don KR, et al. Saliva as a Diagnostic Tool in Oral Squamous Cell Carcinoma – a Systematic Review with Meta Analysis. Pathol Oncol Res 2019;25:447 53. https://doi.org/10.1007/s12253-019-00588-2. 14. Smriti K, Ray M, Chatterjee T, Shenoy R-P, Gadicherla S, Pentapati K-C, et al. Salivary MMP-9 as a Biomarker for the Diagnosis of Oral Potentially Malignant Disorders and Oral Squamous Cell Carcinoma. Asian Pac J Cancer Prev 2020;21:233–8. https://doi.org/10.31557/APJCP.2020.21.1.233 15. Zanoni DK, Patel SG, Shah JP. Changes in the 8th Edition of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) Staging of Head and Neck Cancer: Rationale and Implications. Curr Oncol Rep 2019;21:52. https://doi.org/10.1007/s11912-019-0799-x. 16. Liu X, Su C, Xu J, Zhou D, Yan H, Li W, et al. Immunohistochemical analysis of matrix metalloproteinase 9 predicts papillary thyroid carcinoma prognosis. Oncol Lett 2018. https://doi.org/10.3892/ol.2018.9850. 17. Abrahão, Renata, et al. «Predictors of Survival After Head and Neck Squamous Cell Carcinoma in South America: The InterCHANGE Study». JCO Global Oncology, n.o 6, noviembre de 2020, pp. 486-99. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1200/GO.20.00014. 18. Bastías D, Maturana A, Marín C, Martínez R, Niklander SE. Salivary Biomarkers for Oral Cancer Detection: An Exploratory Systematic Review. IJMS 2024;25:2634. https://doi.org/10.3390/ijms25052634. 19. Thomas GT, Lewis MP, Speight PM. Matrix metalloproteinases and oral cancer. Oral Oncology 1999;35:227–33. https://doi.org/10.1016/S1368 8375(99)00004-4. 20. Ramos-DeSimone N, Hahn-Dantona E, Sipley J, Nagase H, French DL, Quigley JP. Activation of Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) via a Converging Plasmin/Stromelysin-1 Cascade Enhances Tumor Cell Invasion. Journal of Biological Chemistry 1999;274:13066–76. https://doi.org/10.1074/jbc.274.19.13066. 21. Shrestha B, Bajracharya D, Byatnal AA, Kamath A, Radhakrishnan R. May High MMP-2 and TIMP-2 Expressions Increase or Decrease the Aggressivity of Oral Cancer? Pathol Oncol Res 2017;23:197–206. https://doi.org/10.1007/s12253-016-0149-3. 22. Jose D, Mane DR. Correlation of matrix metalloproteinase-9 expression with morphometric analysis of mucosal vasculature in oral squamous cell carcinoma, oral epithelial dysplasia, and normal oral mucosa. Int J Health Sci (Qassim) 2018;12:36–43. 23. Fan H-X, Li H-X, Chen D, Gao Z-X, Zheng J-H. Changes in the expression of MMP-2, MMP-9, and ColIV in stromal cells in oral squamous tongue cell carcinoma: relationships and prognostic implications. J Exp Clin Cancer Res 2012;31:90. https://doi.org/10.1186/1756-9966-31-90. 24. Radulescu R, Greabu M, Totan A, Imre MM, Miricescu D, Didilescu A, et al. Diagnostic Role of Saliva in Oral Cancers. Rev Chim 2020;71:474–80. https://doi.org/10.37358/RC.20.7.8266. |
| dc.rights.coar.fl_str_mv |
http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
| dc.rights.license.spa.fl_str_mv |
Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional |
| dc.rights.uri.spa.fl_str_mv |
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |
| dc.rights.accessrights.spa.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
| rights_invalid_str_mv |
Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| dc.format.extent.spa.fl_str_mv |
37 páginas |
| dc.format.mimetype.spa.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.publisher.spa.fl_str_mv |
Universidad Nacional de Colombia |
| dc.publisher.program.spa.fl_str_mv |
Bogotá - Odontología - Maestría en Odontología |
| dc.publisher.faculty.spa.fl_str_mv |
Facultad de Odontología |
| dc.publisher.place.spa.fl_str_mv |
Bogotá, Colombia |
| dc.publisher.branch.spa.fl_str_mv |
Universidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá |
| institution |
Universidad Nacional de Colombia |
| bitstream.url.fl_str_mv |
https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/87061/1/license.txt https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/87061/2/1026577313.2024%20.pdf https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/87061/3/1026577313.2024%20.pdf.jpg |
| bitstream.checksum.fl_str_mv |
eb34b1cf90b7e1103fc9dfd26be24b4a 586b24aacc8578243d87c1d1f0ecad75 64797db02a59dac31a08422eec7edcae |
| bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv |
MD5 MD5 MD5 |
| repository.name.fl_str_mv |
Repositorio Institucional Universidad Nacional de Colombia |
| repository.mail.fl_str_mv |
repositorio_nal@unal.edu.co |
| _version_ |
1814089829725503488 |
| spelling |
Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Baldión Elorza, Paula Alejandra95fa8df1e377d5f1a04131da6166851aRodríguez-Urrego, Paula A.8c4b9dbbc0363d3ddef17ddf6a674ce4Cruz Romero, Sergio Danilo21062d0c6f9ff3ef840fd58129d21eaf600InvendoDepartamento de Patologia Fsfb Universidad de los Andes Enfermedades ComplejasCruz Romero, Sergio Danilo [0000-0001-9472-7515]2024-10-25T13:56:32Z2024-10-25T13:56:32Z2024https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/87061Universidad Nacional de ColombiaRepositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiahttps://repositorio.unal.edu.co/ilustraciones, diagramas, tablasIntroducción: El carcinoma escamocelular oral (OSCC) es la neoplasia maligna más común en la cavidad oral, con una alta morbilidad y mortalidad. Diversas proteínas, incluidas las metaloproteinasas de matriz (MMP), han sido investigadas como posibles biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de esta enfermedad. Objetivo: Evaluar la utilidad de MMP-2, MMP-9 y el inhibidor tisular de MMP-2 (TIMP-2), como biomarcadores en el diagnóstico y pronóstico del OSCC. Métodos: Se realizó un estudio retrospectivo de casos y controles en pacientes del Hospital Universitario Fundación Santa Fe de Bogotá, de la cohorte Colombiana del estudio InterChange/Headspace, en el cual se reclutaron 60 casos y 30 controles. Se recolectaron muestras de saliva, suero y tejido oral, junto con datos clínicos y sociodemográficos. Las concentraciones de MMP-9, MMP-2 y TIMP-2 en saliva se determinaron mediante ELISA, las muestras de tejido fueron analizadas mediante inmunohistoquímica y se cuantifico la actividad de metaloproteinasas en saliva mediante un ensayo genérico de actividad. Resultados: Los resultados mostraron concentraciones significativamente más altas en saliva de MMP-9 y MMP-2 en el grupo de casos en comparación con los controles, mientras que no se observaron diferencias significativas en TIMP-2. La medición serológica en el 33% de los individuos, reveló una mayor concentración de MMP-9 en los casos. La inmunohistoquímica de MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 en tejido en 40 casos y 20 controles, mostró diferencias entre los casos y los controles, evidenciando una diferencia en la actividad de las MMP entre ambos grupos. Conclusiones: Este estudio destaca el potencial de MMP-9 y MMP-2 en saliva, así como la actividad de las MMP, como posibles biomarcadores para el diagnóstico mediante biopsia líquida de OSCC. Además, sugiere que el enjuague bucal con solución salina es un método eficaz para identificar estas proteínas en saliva. La medición serológica de MMP 9 con valores elevados confirma su utilidad. Aunque la inmunohistoquímica de MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 en tejido mostró diferencias entre los grupos, la presencia ubicua de estas proteínas dificulta su interpretación (Texto tomado de la fuente).Introduction: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common malignant neoplasm in the oral cavity, characterized by high morbidity and mortality. Various proteins, including matrix metalloproteinases (MMPs), have been investigated as potential biomarkers for diagnosing and prognosing this disease. Objective: To evaluate the utility of MMP-2, MMP-9, and tissue inhibitor of MMP-2 (TIMP-2) as biomarkers in diagnosing and prognosing OSCC. Methods: This retrospective case-control study involved 60 cases and 30 controls from the University Hospital Fundación Santa Fe de Bogotá, part of the Colombian cohort of the InterChange/Headspace study. Saliva, serum, and oral tissue samples were collected, along with clinical and sociodemographic data. MMP-9, MMP-2, and TIMP-2 concentrations in saliva were determined using ELISA, while tissue samples were analyzed by immunohistochemistry. MMP activity in saliva was quantified using a generic activity assay.Results: Salivary MMP-9 and MMP-2 concentrations were significantly higher in cases compared to controls, with no significant differences for TIMP2. Elevated MMP-9 concentrations were observed in 33% of serological samples. Immunohistochemistry of MMP-2, MMP-9, and TIMP-2 in tissue revealed differences between cases and controls, indicating variations in MMP activity. Conclusions: This study highlights MMP-9 and MMP-2 in saliva, along with MMP activity, as potential biomarkers for OSCC diagnosis via liquid biopsy. Elevated serological MMP-9 levels support its diagnostic value, although widespread tissue presence complicates interpretation.MaestríaMaestría en Odontología2.1 Diseño del estudio Se realizó un estudio observacional analítico retrospectivo de casos y controles, en el cual se reclutaron pacientes de la Fundación Santa Fe de Bogotá, en un periodo entre los años 2015 y 2022, los cuales hacen parte de la cohorte colombiana del estudio InterChange/HeadSpace. La muestra fue no probabilística por conveniencia. Los criterios de inclusión para los casos fueron: 1) muestras de pacientes ≥ 18 años con diagnóstico confirmado de OSCC; 2) muestras en los que el OSCC estuviera localizado en alguno de los siguientes subsitios: mucosa bucal, paladar, lengua o carrillos; y, 3) pacientes que recibieron tratamiento en el centro de referencia. Se excluyeron pacientes con diagnóstico de carcinoma escamocelular en labio externo o glándula salivales. Los controles fueron reclutados también por la cohorte Colombiana del estudio Interchange/HeadSpace, pareados por sexo y edad en más o menos cinco (5) años, asignando un (1) control por cada dos (2) casos. El criterio de inclusión para la selección de los controles fue que los pacientes estuvieran siendo tratados en la institución hospitalaria, y como criterio de exclusión se estableció que el motivo de la consulta no fuera el padecimiento de enfermedades crónicas o enfermedades asociadas a consumo de alcohol y tabaco. El protocolo de reclutamiento y consentimiento informado fueron aprobados por el comité de ética de la Fundación Santa Fe de Bogotá (CCEI-2424-2014) y el comité de ética de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de Colombia (B. ClEFO-112-2023). A los pacientes reclutados como casos se les tomaron muestras de tejido oral y biopsia líquida (saliva) al momento del diagnóstico. A los individuos reclutados como controles también se les tomó biopsia líquida, y se recolectaron datos socio demográficos y una encuesta relacionada con el estilo de vida. 2.2 Colección de la muestra 2.2.1 Biopsia líquida de saliva La recolección de la muestra se realizó mediante un enjuague bucal durante 60 s con 10 mL de solución salina estéril al 0.9%, el cual se recolectó en tubos de centrífuga cónicos de 50 mL. La muestra se almacenó y se transportó a 4ºC hasta su transformación, por un tiempo no superior a 3 horas desde la recolección de la muestra. Los tubos de 50 mL fueron centrifugados durante 10 min a 2500 x rpm a 4ºC. Posteriormente, se recogieron 4 mL de sobrenadante que se transfirieron a dos criotubos de 1.8 mL, y se almacenaron en un congelador a -80°C. El tiempo entre el procesamiento de la muestra y la medición de los biomarcadores fue dependiente de la fecha de reclutamiento de los pacientes, entre 0 y 7 años. Se obtuvieron muestras de pacientes sanos siguiendo el mismo protocolo para el grupo de casos. 2.2.2 Muestras de suero Se tomaron muestras de sangre en tubos SST de 5 mL. La muestra fue almacenada a 4ºC por un tiempo no mayor a 2 horas hasta su procesamiento. Los tubos fueron centrifugados durante 10 minutos a 3500 x rpm a 4ºC. Posteriormente, mediante una pipeta de transferencia, se pasaron dos alícuotas de suero a dos criotubos, y se almacenaron a -80°C, hasta la detección de los marcadores. El tiempo entre el procesamiento de la muestra y la medición de los biomarcadores fue dependiente de la fecha de reclutamiento de los pacientes, entre 0 y 7 años. 2.3 Detección de biomarcadores por técnica de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas Los niveles en la biopsia líquida en saliva de MMP-2, MMP-9 y TIMP-2, se cuantificaron mediante el kit de ELISA para cada uno de los analitos (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes de comenzar, las muestras y reactivos se llevaron a temperatura ambiente (18 °C) antes de realizar el ensayo. En primer lugar, se realizaron diluciones seriadas del concentrado de cada proteína, para el montaje de la curva estándar, la cual se realizó por duplicado en todos los ensayos. A continuación, se agregaron 100 μL de muestra por pozo en una placa de 96 pozos, y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas y media. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Posteriormente, se desechó el excedente de solución, y se lavaron los pozos con 300 µL de buffer de lavado, proceso que se repitió entre pasos, posterior a la incubación. A continuación, se agregaron 100 µL de anticuerpos de detección a cada pozo, y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Se añadió solución de estreptavidina conjugada con Horseradish Peroxidase (HRP) a cada pozo y se incubó durante 45 minutos. Subsecuente, se adicionó 100 µL de reactivo con 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) como sustrato para la enzima HRP, la cual fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. Por último, se agregaron 100 µL de solución de parada de la reacción a cada pozo y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas ELISA, DYNEX DS2 (Dynex, VA, EE.UU.). El cálculo de las concentraciones mediante a las absorbancias, fue realizado mediante el software, Dynex DS2 2-Plate ELISA Processing System (Dynex). Los resultados de MMP-9 y TIMP-2 fueron convertidos de pg/mL a ng/mL, para facilitar la comparación entre proteínas y con la literatura existente. 2.4 Análisis histopatológico Se obtuvieron muestras de tejido para análisis mediante biopsia o resección quirúrgica, según disponibilidad. Las muestras fueron fijadas en formaldehído al 10% e incluidas en parafina (FFPE). Se realizaron cortes de 4 μm, en micromotomo HM355 (Thermo Fisher Scientific, MA, EE.UU.), que fueron fijados en láminas y se les realizó tinción con hematoxilina-eosina. Un patólogo experto en cabeza y cuello realizó un examen histopatológico que confirmó el diagnóstico de OSCC, además de identificar parámetros histopatológicos como la clasificación histológica del tumor, tamaño, grado histológico, profundidad de la infiltración, invasión linfovascular, márgenes, compromiso óseo, metástasis ganglionar y clasificación TNM según la American Joint Committee on Cancer (AJCC) 8ª edición (15). 2.5 Factores clínicos y sociodemográficos Las variables clínicas y de seguimiento, se recolectaron de la historia clínica del paciente, entre las que se identificaron: tipo de tratamiento (quirúrgico, quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia), respuesta al tratamiento, recurrencia, metástasis y mortalidad asociada al cáncer y comorbilidades. Con respecto a las variables explicativas, todos los casos y controles participaron en una entrevista estandarizada (cuestionario de estilo de vida del estudio InterChange/Headspace) realizada al momento del diagnóstico, durante la cual se recopilaron datos sobre factores sociodemográficos, de estilo de vida y clínicos. Las variables sociodemográficas incluyeron datos demográficos (edad/sexo/etnia/residencia/educación). Las variables de estilo de vida incluyeron historiales completos de consumo de tabaco y alcohol. El uso de tabaco incluyó cigarrillos, cigarros y pipas, y se investigaron 2 aspectos: historial general de tabaquismo (nunca fumador, exfumador o fumador actual), (2) duración del tabaquismo (clasificada como < 10 años y < 5 cigarrilos al dia, o ≥ 10 años y ≥ 5 cigarrilos al día). La intensidad del consumo de alcohol se examinó como historial general de alcohol (nunca bebedor, exbebedor o bebedor actual) e intensidad del consumo de alcohol (clasificada como < 2 días semana, < 5 bebidas al día o ≥2 días semana, ≥ 5 bebidas al día). El consumo de alcohol incluyó todos los tipos de alcohol, como cachaça, vodka, whisky, tequila, ron, ginebra, cerveza y vino. Las condiciones de salud bucal indagadas fueron frecuencia de cepillado al día, uso de prótesis dental, edad de inicio de uso de prótesis, y visita al odontólogo, y se excluyeron pacientes con enfermedad periodontal. Se realizó seguimiento para el análisis de la supervivencia general que fue medida desde la fecha de diagnóstico hasta la muerte por cualquier causa, el final del estudio o la pérdida de seguimiento, lo que ocurriera primero en un periodo de 5 años. La información sobre el estado vital se obtuvo mediante visitas de seguimiento rutinarias y/o vinculando los datos del paciente con estadísticas vitales, archivos de registro de cáncer y expedientes médicos, según las fuentes disponibles en la institución. La IARC proporcionó una base de datos en línea para ingresar la información de seguimiento. Para el análisis principal, se asumió que un paciente estaba perdido para seguimiento cuando no pudo ser rastreado por ninguna fuente de información en los últimos 24 meses antes de la finalización del estudio. 2.6 Detección de biomarcadores en tejido oral 2.6.1 Microarreglos de tejido Se recolectaron 46 bloques de tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) utilizados para el diagnóstico de los pacientes para realizar microarreglos de tejido (TMA), por método manual. En los bloques de parafina se identificaron mediante la fijación en láminas y la tinción con hematoxilina-eosina, zonas representativas del tejido tumoral, que fueron marcadas mediante la observación por parte de un patólogo experto. Posteriormente, de esta zona marcada se extrajeron fragmentos de tejido tumoral (núcleos) de 4 mm de diámetro, del bloque donante por medio del uso de un dispositivo cilíndrico hueco de borde afilado (punch), que se incluyeron posteriormente en un bloque receptor, para obtener un bloque que contenía núcleos de diferentes casos. Después se realizaron cortes del bloque de entre 3 y 4 μm, los cuales fueron montados en láminas. Parte de estas láminas se tiñeron con hematoxilina eosina, como grupo control de la técnica, en los cuales se verificó nuevamente que fuera una muestra representativa y se mantuvieran las características histopatológicas del tejido tumoral. A continuación, se dividieron las láminas en tres grupos, uno por cada analito, MMP-2, MMP-9 y TIMP-2. 2.6.2 Inmunohistoquímica para detección en tejido MMP-2, MMP-9 Y TIMP-2 Las láminas con los TMA, se desparafinizaron con calor seco a 62 °C durante 1 hora, y se realizó la recuperación antigénica inducida por calor a 92 °C, con la solución DakoTarget Retrieval Solution a pH 9 (10X) (Agilent Tecnologies, CA, EE. UU.), durante 40 minutos, con el equipo Dako PTLink (Agilent Tecnologies). Posteriormente, las láminas fueron transferidas al equipo Autostainer Link 48 (Agilent Tecnologies) donde se realizó el proceso de inmunotinción. La actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con EnVision FLEX Peroxidase Blocking Reagent (SM801, Agilent Tecnologies) durante 7 min. Los sitios de unión inespecífica fueron bloqueados mediante la incubación en una solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) con caseína al 1% (C5890, Merck KGaA) durante 10 minutos. Posteriormente, fueron tratadas con un anticuerpo primario policlonal de conejo, específico para cada uno de los analitos: anti-MMP-9 (ab38898, Abcam, MA, EE. UU.), incubado durante 20 min, anti-MMP-2 (ab97779, Abcam) incubado durante 25 min, y anti-TIMP-2 (ab180630, Abcam) incubado durante 30 min. Seguidamente, se añadió el sistema Envision flex HRP (Agilent Tecnologies) durante 20 minutos, polímero de detección de anticuerpos primarios, y se realizó la inmunotinción con EnVision FLEX DAB+ Substrate Chromogen System (Agilent Tecnologies). Se utilizó hematoxilina de Mayer para la contratinción. Como control positivo de los anticuerpos, se emplearon muestras de tejido de carcinoma endometrial como control positivo para la MMP-2 y de carcinoma de colon para el TIMP-2 y la MMP-9. Como control negativo se utilizó el mismo tejido en el cual se realizaron todos los pasos anteriormente descritos, excepto que no se añadió el anticuerpo primario. Como paso subsecuente, después de la inmunotinción, las muestras fueron observadas mediante microscopio óptico Olympus BX46 (Olympus Corporation; Tokio, Japón), por dos patólogos cegados, sin conocimiento de las características clínicas del caso. Se evaluó por intensidad (1+,2+,3+) y por porcentaje de positividad (0% a 100%). Posteriormente, se clasificaron mediante un score que asignó un puntaje por intensidad y porcentaje. Intensidad: (0) ninguna; (1) débil; (2) moderado; (3) fuerte. Porcentaje: (1) ≤25%; (2) 26-50%; (3) 51-75%; y (4)> 75%. Estos puntajes asignados a cada caso se multiplicaron posteriormente para asignar el score final entre 0 y 12 (16). 2.7 Ensayo de actividad de metaloproteinasas de matriz en saliva Se midió la actividad de MMP en saliva utilizando un ensayo de actividad de MMP (Fluorometric - Green; Abcam). Las muestras de saliva se preactivaron con acetato de 4-aminofenilmercúrico (APMA, Abcam), durante 2 horas. La prueba se realizó en una microplaca oscura de 96 pozos (Corning, NY, EE.UU.) en la cual las muestras se incubaron con el sustrato de MMP fluorogénico de isotiocianato de fluoresceína (Abcam) durante 30 minutos. Este ensayo se basa en la utilización de un péptido con transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) como un indicador genérico de la actividad de las MMP. En ausencia de actividad de proteasas se producen señales de baja fluorescencia debido a que el fluorocromo proximal está haciendo quenching del reportero. En presencia de la actividad de proteasas el espaciador de péptido específico para las proteasas es clivado y el fluorocromo es liberado y emite una radiación lumínica fluorescente que permite cuantificarlo. La intensidad de fluorescencia se midió con un espectrofluorómetro de microplacas (Fluoroskan, Thermo Fisher Scientific), con filtros para Ex/Em 485/538. Posteriormente, las unidades de fluorescencia relativa (RFU) se compararon con un control positivo, estándar de MMP a una concentración de 50 ng/mL (Merck KGaA), y como control de inhibición se utilizó ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 1 mM por 15 min previo a la adición del sustrato. 2.8. Análisis estadístico La base de datos se construyó en hojas de cálculo del programa Excel (Microsoft Office 2010), con la codificación de las variables. Se utilizó el paquete estadístico Past 4.16 (University of Oslo, Noruega) para el análisis de datos. Se realizaron análisis descriptivos reportando frecuencias absolutas y relativas, para datos categóricos, medias ± desviación estándar, para datos cuantitativos. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para verificar la distribución de los datos, y se aplicó la prueba la prueba no paramétrica de U de Mann Whitney para comparar la concentración de proteínas en saliva entre sujetos con OSCC y sujetos sanos, así como para analizar la diferencia entre la media de expresión de los distintos marcadores por inmunohistoquímica ente casos y controles. Las concentraciones de los tres biomarcadores en suero se mediante la prueba H de Kruskal Wallis, adicionalmente para explorar las diferencias entre los grupos se utilizó un análisis Post hoc mediante la prueba de Tukey. Se exploró la asociación entre las diferentes características clínicas y demográficas, con las concentraciones y los puntajes calculados mediante el score de los diferentes biomarcadores, mediante la realización de las pruebas no paramétricas de: H de Kruskal Wallis, U de Mann Whitney y Rho de Spearman, dado el incumplimiento del supuesto de distribución normal verificado a través del estadístico de Shapiro Wilk. Se realizó una curva ROC, para estimar el valor diagnóstico de cada una de las proteínas, evaluadas mediante el score de inmunohistoquímica. A partir de la curva ROC se identificaron los puntos de corte óptimos para diferenciar entre casos positivos y negativos. Además, se elaboraron curvas ROC para estimar el valor pronóstico de las concentraciones en las biopsias líquidas salivales y la tinción inmunohistoquímica en tejido, de cada una de las proteínas, en términos de sensibilidad y especificidad.Biología celular y molecular de los carcinomas de cabeza y cuello37 páginasapplication/pdfspaUniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Odontología - Maestría en OdontologíaFacultad de OdontologíaBogotá, ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá610 - Medicina y salud::617 - Cirugía, medicina regional, odontología, oftalmología, otología, audiología610 - Medicina y salud::616 - EnfermedadesCarcinoma de Células EscamosasCarcinoma, Squamous CellNeoplasiasNeoplasmsMetaloproteinasas de la MatrizMatrix MetalloproteinasesBiomarcadores de TumorBiomarkers, TumorCarcinoma escamocelular de la cavidad oralMetaloproteinasas de matrizInhibidor tisular de la metaloproteinasa-2SalivaOral cavity squamous cell carcinomaMatrix metalloproteinasesTissue inhibitor of metalloproteinase-2MMP-2, MMP-9 y TIMP-2 Salivales y tisulares como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico de carcinoma escamocelular oralSalivary and tissue MMP-2, MMP-9, and TIMP-2 as diagnostic and prognostic biomarkers in oral squamous cell carcinomaTrabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTexthttp://purl.org/redcol/resource_type/TM1. Panarese I, Aquino G, Ronchi A, Longo F, Montella M, Cozzolino I, et al. Oral and Oropharyngeal squamous cell carcinoma: prognostic and predictive parameters in the etiopathogenetic route. Expert Review of Anticancer Therapy 2019; https://doi.org/10.1080/14737140.2019.1561288 19: 105–192. Johnson DE, Burtness B, Leemans CR, Lui VWY, Bauman JE, Grandis JR. Head and neck squamous cell carcinoma. Nat Rev Dis Primers 2020;6:92. https://doi.org/10.1038/s41572-020-00224-3.3. Aupérin A. Epidemiology of head and neck cancers: an update. Curr Opin Oncol. 2020 May;32(3):178-186. https://doi.org/10.1097/CCO.0000000000000629.4. Chamoli A, Gosavi AS, Shirwadkar UP, Wangdale KV, Behera SK, Kurrey NK, et al. Overview of oral cavity squamous cell carcinoma: Risk factors, mechanisms, and diagnostics. Oral Oncology 2021; 121: 105451. https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2021.1054515. Ciccone L, Vandooren J, Nencetti S, Orlandini E. Natural marine and terrestrial compounds as modulators of Matrix Metalloproteinases-2 (MMP-2) and MMP-9 in Alzheimer’s disease. Pharmaceuticals 2021; 14: 86. https://doi.org/10.3390/ph14020086 6.6. Nishio K, Motozawa K, Omagari D, Gojoubori T, Ikeda T, Asano M, et al. Comparison of MMP-2 and MMP-9 expression levels between primary and metastatic regions of oral squamous cell carcinoma. Journal of Oral Science 2016; 58: 59–65. https://doi.org/10.2334/josnusd.58.59 7.7. Smriti K, Ray M, Chatterjee T, Shenoy R-P, Gadicherla S, Pentapati K-C, et al. Salivary MMP-9 as a biomarker for the diagnosis of oral potentially malignant disorders and oral squamous cell carcinoma. Asian Pac J Cancer Prev 2020; 21: 233–8. https://doi.org/10.31557/APJCP.2020.21.1.233 8.8. Stamenkovic I. Extracellular matrix remodelling: the role of matrix metalloproteinases. The Journal of Pathology 2003;200:448–64. https://doi.org/10.1002/path.1400.9. Gialeli C, Theocharis AD, Karamanos NK. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. The FEBS Journal 2011;278:16–27. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2010.07919.x.10. Rosenthal EL, Matrisian LM. Matrix metalloproteases in head and neck cancer. Head & Neck 2006;28:639–48. https://doi.org/10.1002/hed.20365.11. Patil R, Mahajan A, Pradeep G, Prakash N, Patil S, Khan S. Expression of matrix metalloproteinase-9 in histological grades of oral squamous cell carcinoma: An immunohistochemical study. J Oral Maxillofac Pathol 2021;25:239. https://doi.org/10.4103/0973-029X.325121.12. Benitha G, Ramani P, Jayaraman S, R A, Ramalingam K, Krishnan M. Evaluation of Serum Levels of Matrix MetalloProteinase-9 (MMP-9) in Oral Squamous Cell Carcinoma and Its Clinicopathological Correlation. Cureus 2023. https://doi.org/10.7759/cureus.34954.13. Hema Shree K, Ramani P, Sherlin H, Sukumaran G, Jeyaraj G, Don KR, et al. Saliva as a Diagnostic Tool in Oral Squamous Cell Carcinoma – a Systematic Review with Meta Analysis. Pathol Oncol Res 2019;25:447 53. https://doi.org/10.1007/s12253-019-00588-2.14. Smriti K, Ray M, Chatterjee T, Shenoy R-P, Gadicherla S, Pentapati K-C, et al. Salivary MMP-9 as a Biomarker for the Diagnosis of Oral Potentially Malignant Disorders and Oral Squamous Cell Carcinoma. Asian Pac J Cancer Prev 2020;21:233–8. https://doi.org/10.31557/APJCP.2020.21.1.23315. Zanoni DK, Patel SG, Shah JP. Changes in the 8th Edition of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) Staging of Head and Neck Cancer: Rationale and Implications. Curr Oncol Rep 2019;21:52. https://doi.org/10.1007/s11912-019-0799-x.16. Liu X, Su C, Xu J, Zhou D, Yan H, Li W, et al. Immunohistochemical analysis of matrix metalloproteinase 9 predicts papillary thyroid carcinoma prognosis. Oncol Lett 2018. https://doi.org/10.3892/ol.2018.9850.17. Abrahão, Renata, et al. «Predictors of Survival After Head and Neck Squamous Cell Carcinoma in South America: The InterCHANGE Study». JCO Global Oncology, n.o 6, noviembre de 2020, pp. 486-99. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1200/GO.20.00014.18. Bastías D, Maturana A, Marín C, Martínez R, Niklander SE. Salivary Biomarkers for Oral Cancer Detection: An Exploratory Systematic Review. IJMS 2024;25:2634. https://doi.org/10.3390/ijms25052634.19. Thomas GT, Lewis MP, Speight PM. Matrix metalloproteinases and oral cancer. Oral Oncology 1999;35:227–33. https://doi.org/10.1016/S1368 8375(99)00004-4.20. Ramos-DeSimone N, Hahn-Dantona E, Sipley J, Nagase H, French DL, Quigley JP. Activation of Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) via a Converging Plasmin/Stromelysin-1 Cascade Enhances Tumor Cell Invasion. Journal of Biological Chemistry 1999;274:13066–76. https://doi.org/10.1074/jbc.274.19.13066.21. Shrestha B, Bajracharya D, Byatnal AA, Kamath A, Radhakrishnan R. May High MMP-2 and TIMP-2 Expressions Increase or Decrease the Aggressivity of Oral Cancer? Pathol Oncol Res 2017;23:197–206. https://doi.org/10.1007/s12253-016-0149-3.22. Jose D, Mane DR. Correlation of matrix metalloproteinase-9 expression with morphometric analysis of mucosal vasculature in oral squamous cell carcinoma, oral epithelial dysplasia, and normal oral mucosa. Int J Health Sci (Qassim) 2018;12:36–43.23. Fan H-X, Li H-X, Chen D, Gao Z-X, Zheng J-H. Changes in the expression of MMP-2, MMP-9, and ColIV in stromal cells in oral squamous tongue cell carcinoma: relationships and prognostic implications. J Exp Clin Cancer Res 2012;31:90. https://doi.org/10.1186/1756-9966-31-90.24. Radulescu R, Greabu M, Totan A, Imre MM, Miricescu D, Didilescu A, et al. Diagnostic Role of Saliva in Oral Cancers. Rev Chim 2020;71:474–80. https://doi.org/10.37358/RC.20.7.8266.InvestigadoresLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-85879https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/87061/1/license.txteb34b1cf90b7e1103fc9dfd26be24b4aMD51ORIGINAL1026577313.2024 .pdf1026577313.2024 .pdfTesis de Maestría en Odontologíaapplication/pdf1173114https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/87061/2/1026577313.2024%20.pdf586b24aacc8578243d87c1d1f0ecad75MD52THUMBNAIL1026577313.2024 .pdf.jpg1026577313.2024 .pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg5181https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/unal/87061/3/1026577313.2024%20.pdf.jpg64797db02a59dac31a08422eec7edcaeMD53unal/87061oai:repositorio.unal.edu.co:unal/870612024-10-25 23:25:17.677Repositorio Institucional Universidad Nacional de Colombiarepositorio_nal@unal.edu.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 |