Determinación de características funcionales de CtpG, una ATPasa tipo P transportadora de metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis (TB). Actualmente, Mtb es el mayor causante de muertes por un agente infeccioso en el mundo. Las principales estrategias para el control de la TB incluyen la quimioterapia, el diagnóstico temprano y la vacunación con el baci...

Full description

Autores:: Quitian Cruz, Laudy Viviana

Tipo de recurso:

Fecha de publicación:: 2017

Institución:: Universidad Nacional de Colombia

Repositorio:: Universidad Nacional de Colombia

Idioma:: spa

Description
Summary:	Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente etiológico de la tuberculosis (TB). Actualmente, Mtb es el mayor causante de muertes por un agente infeccioso en el mundo. Las principales estrategias para el control de la TB incluyen la quimioterapia, el diagnóstico temprano y la vacunación con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG). Sin embargo, el surgimiento de cepas multifármaco resistentes (MDR) y extremadamente fármaco resistentes (XDR) han dificultado el control de la TB. Por lo tanto, se hace prioritario identificar nuevos blancos terapéuticos para así poder desarrollar nuevas alternativas de control. Una de las estrategias que utilizan los macrófagos cuando han fagocitado a Mtb, es aumentar la concentración de metales como hierro, cobre, zinc, potasio, calcio y manganeso, por lo que la micobacteria requiere de sistemas que permitan el eflujo y la detoxificación de metales, para mantener la homeostasis iónica. Específicamente, Mtb codifica 28 genes encargados del transporte de iones metálicos, de los que 12 son genes que codifican ATPasas tipo P que se expresan diferencialmente durante la infección, una amplia cantidad, respecto a otros patógenos intracelulares. Las ATPasas tipo P son enzimas que catalizan el transporte de cationes metálicos en contra del gradiente de concentración, a partir de la hidrólisis del ATP. Su expresión es fundamental para la viabilidad celular debido a su participación en procesos de detoxificación, metalación de otras proteínas y en respuesta a estrés oxidativo. Su localización transmembranal, las hace un blanco terapéutico más accesible a los fármacos, respecto a blancos citoplasmáticos. Se ha reportado que CtpG, una ATPasa tipo P1B, se induce durante la infección de Mtb en macrófagos humanos, en condiciones de hipoxia, inanición y en presencia de sustancias tóxicas como altas concentraciones de metales pesados (Cu2+-500 µM y Zn2+-500 µM) que afectan la viabilidad de Mtb. Adicionalmente CmtR, el regulador transcripcional de ctpG, es sensado por Cd2+ en Mtb H37Rv, lo que sugiere que CtpG podría ser una bomba encargada del eflujo de este metal tóxico. Por todo lo anterior, CtpG podría ser un blanco terapéutico interesante, por lo que se hace importante conocer muchas de sus características funcionales. En el presente trabajo se propuso determinar algunas características de CtpG como la especificidad iónica en membrana de micobacterias, y el comportamiento transcripcional en presencia de concentraciones subletales de metales pesados posiblemente transportados por esta enzima. Además, se desarrollaron herramientas para la producción de anticuerpos policlonales contra CtpG. La expresión de CtpG recombinante se optimizó usando el sistema pBAD A Myc His, en E. coli LMG194. La proteína se expresó en la fracción soluble utilizando 0.3% de L- arabinosa y 8 horas de inducción a 20°C. Así mismo la mayor parte de la proteína se detectó en la fracción insoluble como cuerpos de inclusión en todas las condiciones de cultivo analizadas. Se encontró que los iones Cu2+, Co2+, Cd2+ y Pb2+ inducen la actividad enzimática mediada por CtpG en la membrana plasmática de micobacteria, con valores de 6.25 ± 1.429, 4.1266 ± 0.914, 6.5705 ± 1.694 y 6.2099 ± 1.745 U/mg de proteína, respectivamente. Para hacer un acercamiento a la especificidad iónica, se realizaron ensayos de tolerancia a concentraciones tóxicas de metales pesados en M. smegmatis mc2155 sobreexpresando CtpG. Se encontró que CtpG genera tolerancia a Cd2+ y Cu2+ en células completas de micobacteria. De acuerdo a estos resultados, se determinaron las constantes cinéticas de la proteína recombinante utilizando Cd2+ (Vmáx: 0,856 ± 0,01y Km: 0,108 ± 0,007) y Cu2+ (Vmáx: 1,051 ± 0,155 y Km: 0,981±0,422) como sustratos. Esto permitió apreciar que los iones Cd2+, podrían ser más eficientemente transportados por CtpG.

Determinación de características funcionales de CtpG, una ATPasa tipo P transportadora de metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis

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