Complementación de mutantes de Mycobacterium tuberculosis defectivos en ATPasas tipo P: Construcción de plásmidos integrativos con promotores autoinducibles

ilustraciones, graficas, fotografías

Autores:
Figueroa Castillo, Manuel Orlando
Tipo de recurso:
Fecha de publicación:
2023
Institución:
Universidad Nacional de Colombia
Repositorio:
Universidad Nacional de Colombia
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repositorio.unal.edu.co:unal/86313
Acceso en línea:
https://repositorio.unal.edu.co/handle/unal/86313
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Palabra clave:
570 - Biología::572 - Bioquímica
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En este sentido, las vacunas vivas atenuadas son una de las principales alternativas para reemplazar la actual BCG. por otra parte, teniendo presente el importante papel de las ATPasas tipo p en el control de los gradientes electroquímicos de las micobacterias, estos transportadores de membrana plasmática se consideran objetivos interesantes para la atenuación de Mtb. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación, la complementación de mutantes defectivos en ATPasas tipo P utilizando plásmidos extracromosomales, multicopia, mostraron una expresión muy aumentada de los genes complementados, durante los procesos de estrés e infección in vitro, lo que afecta la recuperación normal de los fenotipos silvestres y las conclusiones de la investigación. Razón por la cual, en el presente trabajo, se evaluó el uso de plásmidos integrativos en la complementación de mutantes de Mtb defectivos en el gen ctpA, que codifica una ATPasa tipo P de membrana plasmática transportadora de Cu 2+. específicamente se comparó la complementación con la proteína CtpA bajo el control del promotor robusto de la proteína hsp60 proveniente de E. coli, con un promotor propio de micobacterias derivado de la proteína antígeno Ag85a, derivado de Mtb. Se observó que bajo una condición de estrés oxidativo inducida con peróxido de hidrogeno 4mM, utilizando los vectores integrativos construidos, la transcripción del gen ctpA en la cepa complementada bajo control del promotor de la proteína Ag85a es dos veces mayor respecto a la expresión génica bajo el promotor hsp60. De esta manera se evidencia que el uso de un promotor propio de Mtb favorece la recuperación de los fenotipos silvestres en comparación al uso de un promotor originario de E. coli, como es el caso de hsp60. Los resultados obtenidos sirvieron para diseñar y construir un sistema de expresión integrativo de la ATPasa tipo P, CtpF (transportador de Ca 2+ a través de la membrana plasmática de Mtb), bajo el control del promotor de Ag85A, para la complementación de mutantes de Mtb defectivos en este transportador (MtbΔctpf), a ser probados en ensayos preclínicos con fines vacunales. (Texto tomado de la fuente)Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the acid-fast bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb). One of the main strategies for the control of TB is the development of new vaccines that replace the current BCG Bacillus Calmette-Guérin, which has limited protection against pulmonary TB in adults. In this sense, live attenuated vaccines are one of the main alternatives to replace the current BCG. On the other hand, taking into account the important role of p-type ATPases in the control of electrochemical gradients in mycobacteria, these plasma membrane transporters are considered interesting targets for the attenuation of Mtb. In previous work by our research group, the complementation of mutants defective in P-type ATPases using extrachromosomal, multicopy plasmids, showed a greatly increased expression of the complemented genes, during stress and infection processes in vitro, which affects normal recovery. of wild phenotypes and research conclusions. For this reason, in the present work, the use of integrative plasmids was evaluated in the complementation of Mtb mutants defective in the ctpA gene, which encodes a Cu2+-transporting plasma membrane P-type ATPase. Specifically, complementation with the ctpA protein was compared under the control of the robust promoter of the hsp60 protein (from E. coli), with a mycobacterial promoter derived from the antigen protein ag85a (derived from Mtb). It will be observed that under a condition of oxidative stress with 4mm hydrogen peroxide, the expression of ctpA in the complemented strain under control of the ag85a protein promoter is two times greater than the gene expression under the hsp60 promoter, using the integrative vectors constructed. In fact, it is reaffirmed that the use of a promoter of an Mtb antigen favors the recovery of wild phenotypes compared to the use of hsp60 originating from E. coli. The results obtained served to build an integrative expression system of the P-type ATPase, ctpF (ca2+ transporter through the plasma membrane of Mtb), under the control of the Ag85a promoter, for the complementation of Mtb mutants defective in this transporter. MtbΔctpf), to be tested in preclinical trials with vaccine fines.MaestríaMagíster en Ciencias - MicrobiologíaBiología Molecular de Micobacterias73 páginasapplication/pdfspaUniversidad Nacional de ColombiaBogotá - Ciencias - Maestría en Ciencias - MicrobiologíaFacultad de CienciasBogotá, ColombiaUniversidad Nacional de Colombia - Sede Bogotá570 - Biología::572 - BioquímicaATPasas Tipo PPlásmidosFenotipoP-type ATPasesPlasmidsFenótipoMycobacterium tuberculosisATPasasPromotoresTranscripciónCepa complementadaMycobacterium TBATPasesPromotersTranscriptionComplemented strainComplementación de mutantes de Mycobacterium tuberculosis defectivos en ATPasas tipo P: Construcción de plásmidos integrativos con promotores autoinduciblesComplementation of P-type ATPase-defective Mycobacterium tuberculosis mutants: construction of integrative plasmids based on the Ag85A promoterTrabajo de grado - Maestríainfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTextOtherhttp://purl.org/redcol/resource_type/TMA. L.-Torres, L. N.-A. (2015). CtpA, a putative Mycobacterium tuberculosis P-type. Biometals.Andrew J. Pollard, E. M. (2021). A guide to vaccinology: from basic principles to new developments. Nature Reviews Immunology, 83-100B. Saviola, W. R. (2004). Method to integrate multiple plasmids into the mycobacterial chromosome. Nucleic Acids Res, 1-4.Babaki, M. S. (2017). Mycobacterium tuberculosis immunogene: Biology, immune pathogenicity, applications in diagnosis, and vaccine desing. Microbial Pathogenesis, 20-29C. K. Stover, V. F. (1991). New use of BCG for recombinant vaccines. Nature, 456-460Cruz, A. (2021). Complementación de un mutante de Mycobacterium tuberculosis defectivo en CtpF, una ATPasa tipo P transportadora de Ca2+. Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Facultad de Ciencias, Departamento de Biologia, Tesis de Pregrado.D. K. Armianinovaa. (2022). Genetic Engineering in Mycobacteria. BACTERIAL GENOME EDITING, 900-912.Farahnaz Movahedzadeh, R. F. (2011). 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