Caracterización preliminar de la enzima Dihidroorotato Deshidrogenasa de la especie Solanum Tuberosum como estrategia para el control del patógeno Phytophthora Infestans (2018)
La papa-solanum tuberosum- es una especie perteneciente a la familia de las solanáceas que se cultiva en más de 100 países, lo que lo convierte en uno de los cultivos más importantes a nivel mundial. Según la organización de las naciones unidas para la alimentación y la agricultura (FAO) la papa se ubica en el cuarto lugar de cultivos con mayor importancia como producto alimenticio después del arroz, trigo y maíz. Los cultivos de papa, al igual que el resto de cultivos, están sujetos a ataques de microorganismos los cuales son causantes de graves enfermedades que provocan pérdidas económicas y de producción. El oomycete Phytophthora infestans (P. Infestans), es el microorganismo causante del tizón tardío, la cual es una de las enfermedades de mayor prevalencia y gravedad en cultivos de solanáceas, dentro de las que se encuentran plantas de importancia agrícola y económica como la papa y el tomate. Para el verano de 1845 la enfermedad del tizón tardío atacó los cultivos de papa, extendiéndose por todo Europa, siendo Irlanda uno de los países más afectados. La enfermedad se propagó sin control en los años siguientes generando la reconocida “Hambruna irlandesa” que resultó en la muerte de un millón y medio de campesinos irlandeses y el éxodo de una gran parte de esta población a países como Estados Unidos y Canadá. Recientemente, estudios con parásitos del Phylum Apicomplexa han demostrado que la ruta metabólica de Pirimidinas, específicamente la síntesis de novo, puede llegar a ser un blanco potencial para la inhibición de distintos patógenos, debido a que los Nucleótidos de Pirimidinas están involucrados en varios procesos celulares críticos y desempeñan funciones estructurales, metabólicas y reguladoras. En la actualidad algunas enzimas de esta ruta de síntesis son importantes en el estudio de la inhibición de estos patógenos, como es el caso del Toxoplasma Gondii, causante de la toxoplasmosis, del cual se ha evidenciado que los parásitos en ausencia de la enzima CPSII (Enzima que cataliza la primera reacción de la ruta) pierden su virulencia; de allí la importancia de esta investigación en la inhibición de patógenos como P. Infestans en hospederos como S. tuberosum. Por tanto, estudios resaltan la importancia de la enzima DHOD debido a que cataliza la única etapa redox de la vía, por lo cual sería de gran importancia la caracterización cinética y funcional de las enzimas tanto del patógeno (PiDHOD) como del hospedero (StDHOD). Gracias a trabajos previos, realizados por el grupo de investigación BBMP (Bioquímica y biología molecular de parásitos) de la Universidad de los Andes, ya se cuenta con la caracterización cinética de la PiDHOD, sin embargo, no se ha caracterizado la StDHOD debido a que la proteína recombinante completa es altamente hidrofóbica y por tanto es insoluble después de ser inducida bajo estrés osmótico. Es por eso, que esta investigación tuvo como objetivo caracterizar en forma preliminar la enzima DHOD de la especie S. tuberosum, mediante la clonación y expresión de tres versiones truncadas de esta en el vector de expresión pET-19b, con el fin de obtener una versión soluble y que preserve su actividad biológica para su posterior caracterización enzimática. Para lo cual se realizó mediante un análisis bioinformático la determinación de la región N’-terminal a suprimir, a partir de esto se realizaron tres truncaciones independientes de la proteína, delecionando los primeros 69,73 y 76 aminoácidos denominadas AST, DEA y TFC respectivamente; las cuales fueron clonadas en el vector pET-19b, expresadas en células de BL21-CodonPlus(DE3)RP de E. coli, luego fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad utilizando resinas de cobalto. Finalmente se realizó la respectiva caracterización cinética, mediante el espectrofotómetro DU 800 (Beckmann Coulter) evaluando la reacción de reducción del 2,6 diclorofenolindofenol (DCIP), de color azul, en una reacción acoplada al sustrato dihidroorotato (L-DHO) a través de la oxidación del sustrato de quinona (Qd) que cambia a incoloro, lo que permitió obtener las curvas de saturación de cada uno de los sustratos de la StDHOD (L-DHO y Qd) y calcular por medio de la ecuación de Michaelis-Menten las constantes cinéticas más relevantes para las dos versiones que tenían mayor probabilidad de preservar la actividad enzimática (AST y DEA): Km y Vmax (enzima recombinante AST KmL-DHO: 23,65 µM, KmQd: 22,85 µM, y el VmaxL-DHO: 21,40 µmol/mg/min VmaxQd: 20,60 µmol/mg/min, mientras que para la enzima recombinante DEA, sólo se establecieron las variables cinéticas para el sustrato L-DHO: KmL-DHO: 22,59 µM y VmaxL-HO: 17,67 µmol/mg/min y se mantuvo constante la concentración de Qd, lo que permitió demostrar que para ambas versiones de las enzimas truncadas, los Km son muy cercanos). La diferencia en las constantes cinéticas entre la enzima StDHOD y PiDHOD (KmL-DHO: 16,9 µM, KmQd: 6 µM y Vmax: 5,8 µmol/mg/min), podrían ser exploradas en la búsqueda de compuestos con capacidad inhibitoria que tuviera un gran efecto sobre la enzima del patógeno sin afectar la actividad de la enzima de la planta. En conclusión, este estudio abre el camino para investigaciones relacionadas con el control del patógeno P. infestans en cultivos de papa, afianzando a la enzima DHOD como blanco prometedor para la inhibición de este oomycete. Se espera entonces que con este estudio se faciliten futuras investigaciones en el campo de la farmacología, como también se afiance la ruta de síntesis de novo de pirimidinas como un blanco para el control de diversos patógenos que, como el P. infestans, se han convertido en un organismo nocivo para cultivos de gran importancia alimenticia para la humanidad.