Expresión diferencial de genes en monocitos SLAN+/- tratados o no con vesículas extracelulares de pacientes con nefritis lúpica. Una evidencia de la capacidad moduladora de estas vesículas extracelulares (2025)
La NL es una manifestación compleja y de difícil diagnóstico que afecta a aproximadamente el 50-60% de los pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico. A pesar de la existencia de un esquema de tratamiento aceptado internacionalmente, en algunos casos hay fallo terapéutico y/o recaídas que llegan a ocasionar pérdida total de la función renal o incluso la muerte. La NL es considerada una reacción de hipersensibilidad tipo III, donde complejos inmunes se depositan en el glomérulo renal y estimulan respuestas inflamatorias locales, lo que induce la formación de microtrombos y daño del tejido y afectando la función del órgano. Al ser parte de una enfermedad sistémica, se hace necesario un mayor entendimiento de los procesos biológicos y mecanismos moleculares que desde circulación pudiesen estar contribuyendo al desarrollo de la enfermedad. El objetivo de este trabajo fue identificar las diferencias en el perfil transcripcional de los monocitos y subpoblaciones SLAN+/-, aisladas mediante el método de separación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), desde sangre periférica de pacientes con NL de reciente diagnóstico y controles. Así como la evaluación del perfil transcripcional de MSN-Ctrl posterior al tratamiento con pVEs. Previa exposición de los monocitos a las VEs, se realizó una caracterización físico-química y fenotípica de éstas y se compararon con las de controles mediante técnicas de alta sensibilidad para el estudio de nanopartículas. El estudio de las VEs es un campo de muy reciente interés por lo que hasta el inicio de este estudio muchos conceptos y metodologías estaban siendo unificados. En cada capítulo se describen en detalle las diferentes metodologías empleadas para los análisis de partículas (VEs), subpoblaciones de monocitos y los respectivos transcriptomas. Fue necesario el entrenamiento y estandarización de protocolos para analizar las VEs en técnicas especializadas que no son de uso frecuente en estudios con muestras humanas como la microscopía electrónica en campo oscuro con Espectro de Emisión de Rayos X (EXDS, por sus siglas en inglés) para la evaluación elemental, y la dispersión de luz dinámica con análisis de potencial ζ para analizar la distribución de tamaño y carga de las VEs. Además, dado que este estudio involucró la obtención de un número muy limitado de células (en particular por los MSP), inicialmente fue necesario estandarizar un protocolo para la obtención eficiente de las subpoblaciones de monocitos, así como la estandarización y optimización de la extracción de ARN de alta calidad a partir de un número bajo de células. Posterior a la etapa de estandarización, se llevaron a cabo los diferentes análisis cuyos resultados destacados se resumen a continuación: En relación con la caracterización físico-química de las VEs de pacientes con LES (VEs-LES), con y sin NL, se observó heterogeneidad en los tamaños por microscopía electrónica y por DLS (desde 30nm hasta 2µm). Las VEs-LES alcanzaron diámetros mayores que las VEs de controles (VEs-Ctrl). Los tamaños extremos, es decir, las VEs-LES pequeñas y las VEs-LES grandes aumentaron en frecuencia comparado con las VEs-Ctrl. Adicional a esto, los pacientes tuvieron concentraciones más altas de VEs grandes en comparación con los controles. Llamativamente las VEs-LES mostraron un espectro de emisión de rayos X diferente y fueron menos electronegativas que las VEs-Ctrl. Las VEs-CD45+, CD14+, e IgM+ fueron más frecuentes en pacientes con LES en comparación con los controles y las concentraciones de VEs grandes junto a las VEs-IgM+ permitieron una mejor discriminación entre pacientes y controles. Las subpoblaciones de monocitos (clásicos, intermedios y no clásicos), fueron fenotipificadas y cuantificadas mediante citometría de flujo. Se evidenció una reducción en el número y frecuencia de monocitos no clásicos y SLAN+ en los pacientes con LES con y sin compromiso renal. Luego, en vista de la heterogeneidad clínica de los pacientes; el grupo con diagnóstico de NL fue subclasificado según la fase de tratamiento. Se observó nuevamente la reducción de las dos fracciones de monocitos (no clásicos y SLAN+) durante la fase de inicio, pero además se observó una tendencia al incremento de estas células en pacientes que se encontraban en fase posterior o de mantenimiento. Para los análisis transcripcionales, inicialmente se realizó un enriquecimiento de todos los monocitos presentes en sangre periférica sin discriminarlos por subpoblación (Monocitos Totales, MT). El análisis de expresión diferencial entre los MT de pacientes NL (MT-NL) y controles (MT-Ctrl), mostró dos perfiles transcripcionales distintos donde los MT-NL enriquecieron vías relacionadas con respuesta inflamatoria como TNF-α NF-kB, IFN-y e IFN-α comparado con los MT-Ctrl. Adicionalmente, se analizaron las posibles interacciones de proteínas de los genes regulados positivamente en los MT-NL. Este análisis mostró tres nodos de interacción que relacionan en mayor proporción a proteínas inducidas en respuesta a IFN, unión de oxígeno y angiogénesis. Debido al marcado incremento en la expresión de genes de respuesta a IFN, se realizó un análisis de co-ocurrencia en el que se identificaron los genes compartidos con una firma de genes de respuesta a IFN reportada en interferonopatías (IRS, por sus siglas en inglés), dentro de las que se incluye el LES. 39 Después de excluir la lista IRS, se llevó a cabo un segundo análisis de co-ocurrencia comparando los genes diferencialmente expresados entre los MT-NL y aquellos previamente reportados en un estudio sobre monocitos aislados de pacientes con LES. De esta forma se identificaron los transcritos compartidos entre el transcriptoma de nuestros pacientes con NL y el transcriptoma de los monocitos de pacientes con LES distintos a la IRS. Esta estrategia permitió reconocer genes relacionados con vías patogénicas que estarían contribuyendo a la patogénesis del LES y el compromiso renal. Posteriormente, los genes compartidos se clasificaron según el tipo de IFN responsable de su inducción donde se evidenció que no solo los genes inducidos por IFN-I son expresados diferencialmente. Por otro lado, el análisis de expresión diferencial de genes entre las fracciones de MSP-NL comparado con MSP-Ctrl, mostró que los genes regulados positivamente por los MSP-NL enriquecieron el “Hallmark” de respuesta al IFN-α mientras que el análisis de ontología génica (GO, por sus siglas en inglés), reveló que los genes de mayor expresión están involucrados con regulación de la proliferación, diferenciación y adhesión celular. Posteriormente, se identificaron los genes diferencialmente expresados entre la fracción MSP-NL y MSN-NL. En este caso, se obtuvo un enriquecimiento de genes que son blanco del factor de transcripción E2F y el análisis GO de los transcritos pertenecientes a este “Hallmark” reveló enriquecimiento de vías de respuesta a daño del ADN, adherencia y diferenciación celular. Dado nuestro interés por conocer el efecto de las VEs en el perfil transcripcional de los monocitos se analizó la expresión diferencial de genes de los MSN-Ctrl tratados con pVEs (MSN-Ctrl-VEs) y los monocitos no tratados (MSN-Ctrl). Inicialmente, generamos una matriz con las firmas transcripcionales previamente reportadas por Loon et al. y Hofer et al. de cada una de las subpoblaciones de monocitos. Luego, usando el paquete de GSEA en R realizamos el análisis de enriquecimiento por grupo de genes. Los transcritos regulados positivamente luego del tratamiento con VEs enriquecieron la firma de MSP y los “Hallmarks” relacionados con respuesta a daño, inflamación, proliferación y diferenciación celular. En conjunto, se identificó que las VEs de pacientes tienen propiedades físico-químicas distintas a los controles, y que las subpoblaciones de monocitos SLAN+/- de pacientes expresan diferencialmente genes asociados a procesos biológicos que, desde sangre periférica; son relevantes para la patogénesis de la NL. Adicionalmente, los perfiles transcripcionales observados en monocitos SLAN+ en sangre periférica de pacientes con NL sugieren una activación diferencial que podría estar relacionada con funciones inmunopatológicas, y merecen investigación funcional adicional. Dirigirse a estas vías puede ofrecer nuevas estrategias para el diagnóstico e intervención terapéutica de la NL.