Generación y caracterización de cultivos 2D y 3D para el estudio de la EAF (PSEN1 E280A) y su aplicación en el diseño de terapias alternativas (2023)
RESUMEN: La Enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo de mayor prevalencia en el mundo. Se caracteriza clínicamente por pérdida progresiva de la memoria y alteraciones cognitivas y neuropatológicamente, por la presencia de placas seniles, ovillos neurofibrilares y pérdida neuronal. Dentro de las causas genéticas de la enfermedad se ha identificado la mutación en el gen PRESENILINA 1 (PSEN1) que resulta en el cambio de un ácido glutámico por una alanina en la posición 280 de la proteína (E280A), dando origen a la EA familiar (EAF) en Antioquia. La EAF está asociada con la presentación de marcadores histopatológicos como las placas seniles, las cuales están compuestas por el péptido β-amiloide de 42 aminoácidos (βA42) en la región cortical del cerebro, ovillos neurofibrilares intracelulares compuestos por la proteína Tau hiperfosforilada, pérdida progresiva de neuronas colinérgicas del hipocampo y la gliosis o activación de la glia. Todos estos hallazgos neuropatológicos involucran el fenómeno de estrés oxidativo (EO), que finalmente conduce a la muerte neuronal. Hasta el presente, no existe un modelo que reproduzca el espectro completo de la neuropatología de la EAF con la mutación E280A en la PSEN1 de forma natural. Adicionalmente, no existe ningún tratamiento terapéutico eficaz o definitivo destinado a reducir o retardar la presentación clínica de la EAF. En este sentido, durante los últimos años, se ha postulado el potencial efecto neuroprotector de algunas moléculas naturales y/o sintéticas, como los cannabinoides (v. gr. CP55940), la Epigalocatequina-3-galato (EGCG) y la melatonina. Sin embargo, su efecto neuroprotector no se ha estudiado aún en modelos in vitro específicos de la EAF PSEN1 E280A. Por lo tanto, en la presente tesis nos propusimos establecer y analizar dos modelos de estudio de la EAF; un modelo planar de cultivos 2D y uno tridimensional 3D de la EAF (PSEN1 E280A) a partir de Células mesenquimales estromales (CME) -provenientes de donantes voluntarios- a las que se les tamizó en búsqueda de la mutación (PSEN1 E280A); lo que nos permitiría la recapitulación neuropatológica de la enfermedad y la evaluación del efecto neuroprotector de moléculas como el cannabinoide CP55940, la EGCG y la melatonina. En este contexto, las CME silvestres (PSEN1 WT) y con la mutación (PSEN1 E280A) fueron aisladas de cordón umbilical y sangre menstrual, caracterizadas y transdiferenciadas a neuronas colinérgicas (NCL) y esferoides cerebrales (EC). Una vez obtenidos los cultivos 2D de NCL PSEN1 WT y PSEN1 E280A, se evaluaron los marcadores neuropatológicos de EO y de apoptosis (v.gr. sAPPβfi /βA42e, Tau-P/Tau-T y DJ-1Ox) en presencia o ausencia de CP55940 y la EGCG y posteriormente, se evaluaron marcadores de EO y muerte celular. De igual manera, en el modelo 3D, los EC PSEN1 WT y PSEN1 E280A fueron cultivados en presencia o ausencia de EGCG y melatonina, después de lo cual se evaluaron marcadores de EO y muerte celular. Como resultados de este trabajo, se logró el aislamiento de las CME de la gelatina de Wharton y sangre menstrual, la caracterización del fenotipo, diferenciación y transdiferenciación a NCL en 2D y 3D de las CME PSEN1 WT y PSEN1 E280A. Así mismo, se demostró, en ambos modelos, la recapitulación de la neuropatología de la EAF PSEN1 E280A con el aumento del sAPPβf/βA42 endógeno y la fosforilación de Tau en las células PSEN1 E280A, comparadas con las silvestres. Además, se evidenció que las células PSEN1 E280A poseen niveles altos de EO y de marcadores de muerte (v.gr. p53, c-JUN, PUMA y CASPASA3), junto con pérdida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y fragmentación del ADN. Igualmente, los cultivos 2D y 3D mutados mostraron una desregulación del flujo de Ca2+ y una actividad deficiente de acetilcolinesterasa (AChE) en comparación con los WT. Destacándose en el modelo 3D la activación en un menor tiempo -y mucho más notoria- de los marcadores neuropatológicos de la EAF en tan solo 11 días. Se evidenció que el CP55940, la EGCG y la melatonina disminuyen el EO, los niveles de expresión del sAPPβf/βA42 y restituye el ΔΨm, y regula el flujo de Ca2+ en las células PSEN1 E280A. Estos resultados contribuyen, por primera vez con: 1) el establecimiento y validación de modelos preclínicos 2D y 3D derivados de CME con la mutación E280A PSEN1 para el estudio de la fisiopatología de la EAF 2) la validación del uso de estos modelos en el diseño de terapias alternativas en la EAF, con lo que adicionalmente, en estos modelos se evaluó y evidenció el potencial efecto neuroprotector de CP55940, EGCG y melatonina como antioxidantes y anti-amiloidogénicos reduciendo los niveles de los marcadores neuropatológicos, de EO y de muerte en este modelo pre-clínico de la EAF en Antioquia. Palabras clave: Células Mesenquimales Estromales, Enfermedad de Alzheimer Familiar, polifenoles, cannabinoides, melatonina, mutación E280A, Estrés oxidativo, cultivos 2D, esferoides cerebrales, organoides.