Estandarización de técnicas moleculares basadas en amplificación y análisis de restricción para la identificación de especies de Aspergillus spp (2020)
RESUMEN: La implementación de las técnicas moleculares permitió la identificación y clasificación de las especies de Aspergillus en secciones, incorporando modificaciones en la taxonomía a partir de los análisis filogenéticos. Objetivos: Identificar aislamientos de Aspergillus spp. pertenecientes al banco de cepas de la escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia, mediante el empleo de los métodos moleculares PCR y PCR-RFLP. Métodos: Se realizó caracterización macroscópica y microscópica inicial de los aislamientos de Aspergillus spp., se eligieron 17 cepas de trabajo a las cuales se les realizó extracción de ADN genómico, posteriormente se estandarizaron las condiciones de trabajo de PCR y PCR-RFLP. Resultados: Se confirmó la morfología de las 17 cepas de Aspergillus, utilizando las claves para el género Aspergillus de Piontelli E. 2008. Para la amplificación por PCR se realizó inicialmente el proceso de estandarización de las condiciones de trabajo, mediante gradientes de temperatura realizados para cada par de cebadores (ITS1F/ITS4R, V9GF/LS266R, CaM2F/CaM2R y BTUBF/BTUBR), los resultados de la tipificación molecular por PCR para cada uno de los aislamientos presentó amplificación de ADNg para los 3 genes estudiados (β-tubulina, calmodulina y la región ITS), para gen de β-tubulina se obtuvieron bandas entre 549 y 574 pb para los aislamientos Afl2, Afl3, Af1, Acl2, At1 y At4, cuyos tamaños eran los esperados de acuerdo con la digestión in silico realizada, para calmodulina se observaron bandas de tamaños esperados entre 727 y 798 pb para los aislamientos Afl2, Afl3, Af1, And1, An2, At1 y At4, para el gen ITS1 los aislamientos Afl2, Afl3, Afl4, Af1, At4 y An2 presentan bandas de tamaños esperados entre 602 y 945 pb, finalmente la región ITS2 mostró amplificación en todos los aislamientos con tamaños de bandas esperados entre 965 y 1243 pb. La PCR-RFLP se utilizó como técnica complementaria a la PCR, con la finalidad de llevar la identificación hasta nivel de especie, la digestión de β-tubulina con TaqI genera bandas específicas para A. flavus (Afl3), A. fumigatus (Af1), A. terreus (At1), cuyos números de cortes coinciden con los esperados según la digestión in silico, en el caso de la digestión con calmodulina, se observó que una sola cepa presentó corte (Af1), generando tres perfiles con tamaños de banda de ~ 200, 280 y 290 pb, por último, la región ITS mostró patrones de diferenciación en las cepas A. fumigatus (Af1), A. versicolor (Av2) y A.hollandicus (Ah1). Conclusiones: Al complementarse la identificación molecular con la RFLP, de los tres genes estudiados, se concluye que los mejores resultados se obtuvieron con los genes β-tubulina digerido con la enzima Taq1, que discrimino un total de 3 especies: A. flavus (Afl3), A. fumigatus (Af1) y A. terreus (At1), e ITS1 con la enzima AvaII con las especies A. fumigatus, A.versicolor y A. hollandicus.