Diseño y validación de un kit in-house para el aislamiento de ácido ribonucleico de SARS-CoV-2
Objetivo. Desarrollar diferentes formulaciones del prototipo de kit in house para el aislamiento de ácido ribonucleico de SARS-CoV-2. Materiales y Métodos. Se realizó un estudio experimental donde se utilizaron 78 muestras criopreservadas de hisopados nasofaríngeos recolectadas entre los años 2021 y...
- Autores:
-
Ballesteros Villamizar, Jolaime Inés
Gutiérrez Zuñiga, Rosa María
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2024
- Institución:
- Universidad de Córdoba
- Repositorio:
- Repositorio Institucional Unicórdoba
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.unicordoba.edu.co:ucordoba/8061
- Acceso en línea:
- https://repositorio.unicordoba.edu.co/handle/ucordoba/8061
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- Palabra clave:
- Extracción de ARN
Prototipo
RT-qPCR
COVID-19
RNA extraction
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- embargoedAccess
- License
- Copyright Universidad de Córdoba, 2024
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Objetivo. Desarrollar diferentes formulaciones del prototipo de kit in house para el aislamiento de ácido ribonucleico de SARS-CoV-2. Materiales y Métodos. Se realizó un estudio experimental donde se utilizaron 78 muestras criopreservadas de hisopados nasofaríngeos recolectadas entre los años 2021 y 2022; pertenecientes al banco de muestras del Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico con diagnóstico confirmado a través de RT-PCR Multiplex para COVID-19. Estas muestras habían sido extraídas previamente con un kit comercial el cual usa columnas de sílice; por lo que fue considerado como kit de referencia para realizar la validación del kit in house. Este estudio incluye el diseño y elaboración de las formulaciones de cada uno de los reactivos del prototipo de kit in house; el cual tiene como ingrediente activo el Isotiocianato de guanidino; además, se realizará el diseño y desarrollo del protocolo para la extracción de ARN utilizando el método de extracción orgánica. Finalmente, se validará el prototipo diseñado, realizando comparaciones de la cuantificación del ARN extraído y de los ciclos de detección de SARS-CoV-2 por medio de RT-PCR Multiplex en tiempo real, frente al kit de referencia; evaluando finalmente, parámetros de validación analítica para el kit in house. Resultados. Se espera obtener un kit in house validado en condiciones de laboratorio, con precisión diagnóstica para la detección molecular de SARS-CoV-2; contribuyendo así, al desarrollo de técnicas de diagnóstico confiables. Conclusiones. Se desarrolló un método basado en la extracción orgánica con Isotiocianato de guanidino; con la elaboración de un buffer de lisis de bajo costo, libre de fenol, amigable con el medio ambiente, con una óptima actividad biológica y con aplicabilidad a técnicas de biología molecular para el diagnóstico de SARS-CoV-2. |
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Teoría y práctica para la extracción y purificación del ADN de palma de aceite. . PALMAS. 2002; Vomelová I, Vanícková Z, Sedo A. Methods of RNA purification. All ways (should) lead to Rome. Folia Biol (Praha). 2009;55(6):243–51. Reina J. El SARS-CoV-2, una nueva zoonosis pandémica que amenaza al mundo. Vacunas. 2020 Jan;21(1):17–22. Parikh R, Mathai A, Parikh S, Chandra Sekhar G, Thomas R. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45. Vizcaíno Salazar G. Importancia del cálculo de la sensibilidad, la especificidad y otros parámetros estadísticos en el uso de las pruebas de diagnóstico clínico y de laboratorio . 2017; Monaghan TF, Rahman SN, Agudelo CW, Wein AJ, Lazar JM, Everaert K, et al. Foundational Statistical Principles in Medical Research: Sensitivity, Specificity, Positive Predictive Value, and Negative Predictive Value. Medicina (B Aires). 2021 May 16;57(5):503. Universidad Johns Hopkins (Baltimore EEUU). La pandemia de coronavirus sigue propagándose y matando a un ritmo sin precedentes. 2022. Wu Z, McGoogan JM. Characteristics of and Important Lessons From the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Outbreak in China. JAMA. 2020 Apr 7;323(13):1239. Vandenberg O, Martiny D, Rochas O, van Belkum A, Kozlakidis Z. Considerations for diagnostic COVID-19 tests. Nat Rev Microbiol. 2021 Mar 14;19(3):171–83. Desjardins P, Conklin D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments. 2010 Nov 22;(1). Organización Mundial de la Salud, Organización Panamericana de la Salud. Detección y diagnóstico de SARS-CoV-2 en el contexto de la circulación de la variante de preocupación Ómicron. Organización Mundial de la Salud. 2021; Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem [Internet]. 1987 Apr;162(1):156–9. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0003269787900212 Farrell RE. RNA Isolation Strategies. In: RNA Methodologies. Elsevier; 2005. p. 67–113. Possebon FS, Ullmann LS, Malossi CD, Miodutzki GT, da Silva EC, Machado EF, et al. A fast and cheap in-house magnetic bead RNA extraction method for COVID-19 diagnosis. J Virol Methods. 2022 Feb;300:114414. Amirouche A, Ait-Ali D, Nouri H, Boudrahme-Hannou L, Tliba S, Ghidouche A, et al. TRIzol-based RNA extraction for detection protocol for SARS-CoV-2 of coronavirus disease 2019. New Microbes New Infect. 2021 May;41:100874. Shen CH. Extraction and Purification of Nucleic Acids and Proteins. In: Diagnostic Molecular Biology. Elsevier; 2019. p. 143–66. TESENA P, KORCHUNJIT W, TAYLOR J, WONGTAWAN T. Comparison of commercial RNA extraction kits and qPCR master mixes for studying gene expression in small biopsy tissue samples from the equine gastric epithelium. J Equine Sci. 2017;28(4):135–41. Mallmann L, Hermann BS, Schallenberger K, Demoliner M, Eisen AKA, Heldt FH, et al. Proteinase K treatment in absence of RNA isolation classical procedures is a quick and cheaper alternative for SARS-CoV-2 molecular detection. J Virol Methods. 2021 Jul;293:114131. He H, Li R, Chen Y, Pan P, Tong W, Dong X, et al. Integrated DNA and RNA extraction using magnetic beads from viral pathogens causing acute respiratory infections. Sci Rep. 2017 Mar 23;7(1):45199. Reyes-Calderón A, Mindreau-Ganoza E, Pardo-Figueroa B, Garcia-Luquillas KR, Yufra SP, Romero PE, et al. Evaluation of low-cost SARS-CoV-2 RNA purification methods for viral quantification by RT-qPCR and next-generation sequencing analysis: Implications for wider wastewater-based epidemiology adoption. Heliyon. 2023 Jun;9(6):e16130. Lu Y, Sun Z. SARS-CoV-2 Molecular Diagnostics in China. Clin Lab Med. 2022 Jun;42(2):193–201. Palacio Rua K, García Correa JF, Aguilar-Jiménez W, Afanador Ayala C, Rugeles MT, Zuluaga AF. 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Estas muestras habían sido extraídas previamente con un kit comercial el cual usa columnas de sílice; por lo que fue considerado como kit de referencia para realizar la validación del kit in house. Este estudio incluye el diseño y elaboración de las formulaciones de cada uno de los reactivos del prototipo de kit in house; el cual tiene como ingrediente activo el Isotiocianato de guanidino; además, se realizará el diseño y desarrollo del protocolo para la extracción de ARN utilizando el método de extracción orgánica. Finalmente, se validará el prototipo diseñado, realizando comparaciones de la cuantificación del ARN extraído y de los ciclos de detección de SARS-CoV-2 por medio de RT-PCR Multiplex en tiempo real, frente al kit de referencia; evaluando finalmente, parámetros de validación analítica para el kit in house. Resultados. Se espera obtener un kit in house validado en condiciones de laboratorio, con precisión diagnóstica para la detección molecular de SARS-CoV-2; contribuyendo así, al desarrollo de técnicas de diagnóstico confiables. Conclusiones. Se desarrolló un método basado en la extracción orgánica con Isotiocianato de guanidino; con la elaboración de un buffer de lisis de bajo costo, libre de fenol, amigable con el medio ambiente, con una óptima actividad biológica y con aplicabilidad a técnicas de biología molecular para el diagnóstico de SARS-CoV-2.Objective. To develop different formulations of the prototype in-house kit for the isolation of SARS-CoV-2 ribonucleic acid. Materials and Methods. An experimental study was carried out using 78 samples of nasopharyngeal swabs collected between 2021 and 2022 inthe Biological Research Institute of the Tropics with diagnosis confirmed through RT-PCR Multiplex for SARS-CoV-2. Those samples were previously been extracted with a commercial kit which uses silica columns; therefore and it will be considered our reference kit to validate the in-house kit. This study includes the design and elaboration of the formulations of each of the reagents of the prototype kit in house; which will have as an active ingredient the guanidinium isothiocyanate.In addition, the design and development of the protocol for the RNA extraction will be carried out using the organic extraction method. Finally, the prototype designed will be validated, making comparisons of the quantification of the extracted RNA and the detection cycles of SARS-CoV-2 by means of RT-PCR Multiplex in real time with theinal evaluation of the analytical validation parameters of the kit in house. Results. We expect to obtain an in-house kit validated under laboratory conditions, with diagnostic precision for the molecular detection of SARS-CoV-2, thus contributing to the development of reliable diagnostic techniques. Conclusions. We developed a method based on organic extraction with guanidinium isothiocyanatewith the elaboration of a low-cost lysis buffer, phenol-free andenvironmentally friendly with optimal biological activity and applicability to molecular biology techniques for the diagnosis of SARS-CoV-2.PregradoBacteriólogo(a)Artículoapplication/pdfspaUniversidad de CórdobaFacultad de Ciencias de la SaludMontería, Córdoba, ColombiaBacteriologíaCopyright Universidad de Córdoba, 2024https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)info:eu-repo/semantics/embargoedAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_f1cfDiseño y validación de un kit in-house para el aislamiento de ácido ribonucleico de SARS-CoV-2Trabajo de grado - Pregradoinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1finfo:eu-repo/semantics/acceptedVersionTextDelshad M, Sanaei MJ, Pourbagheri-Sigaroodi A, Bashash D. Host genetic diversity and genetic variations of SARS-CoV-2 in COVID-19 pathogenesis and the effectiveness of vaccination. Int Immunopharmacol. 2022 Oct;111:109128.Yi-Song Liew T, Zhi Qiang Seah B, Chua CG, Boon Chuan Tan B. Management of SARS-CoV-2 in the Military and Lessons for Future Pandemics. Mil Med. 2022 Dec 5;187(Special Issue_13):e1530–7.Emrani J, Ahmed maryam, Jeffers L, Teleha JC, Mowa N, Newman RH, et al. SARS-COV-2, infection, transmission, transcription, translation, proteins, and treatment: A review. Int J Biol Macromol. 2021 Dec 15;193:1–25.Red Nacional de Biobancos. Protocolo de Extracción de Ácidos Nucleicos. 2011.Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006 Aug 27;1(2):581–5.Rocha Salavarrieta Pedro. Teoría y práctica para la extracción y purificación del ADN de palma de aceite. . PALMAS. 2002;Vomelová I, Vanícková Z, Sedo A. Methods of RNA purification. All ways (should) lead to Rome. Folia Biol (Praha). 2009;55(6):243–51.Reina J. El SARS-CoV-2, una nueva zoonosis pandémica que amenaza al mundo. Vacunas. 2020 Jan;21(1):17–22.Parikh R, Mathai A, Parikh S, Chandra Sekhar G, Thomas R. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45.Vizcaíno Salazar G. Importancia del cálculo de la sensibilidad, la especificidad y otros parámetros estadísticos en el uso de las pruebas de diagnóstico clínico y de laboratorio . 2017;Monaghan TF, Rahman SN, Agudelo CW, Wein AJ, Lazar JM, Everaert K, et al. Foundational Statistical Principles in Medical Research: Sensitivity, Specificity, Positive Predictive Value, and Negative Predictive Value. Medicina (B Aires). 2021 May 16;57(5):503.Universidad Johns Hopkins (Baltimore EEUU). La pandemia de coronavirus sigue propagándose y matando a un ritmo sin precedentes. 2022.Wu Z, McGoogan JM. Characteristics of and Important Lessons From the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Outbreak in China. JAMA. 2020 Apr 7;323(13):1239.Vandenberg O, Martiny D, Rochas O, van Belkum A, Kozlakidis Z. Considerations for diagnostic COVID-19 tests. Nat Rev Microbiol. 2021 Mar 14;19(3):171–83.Desjardins P, Conklin D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments. 2010 Nov 22;(1).Organización Mundial de la Salud, Organización Panamericana de la Salud. Detección y diagnóstico de SARS-CoV-2 en el contexto de la circulación de la variante de preocupación Ómicron. Organización Mundial de la Salud. 2021;Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem [Internet]. 1987 Apr;162(1):156–9. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0003269787900212Farrell RE. RNA Isolation Strategies. In: RNA Methodologies. Elsevier; 2005. p. 67–113.Possebon FS, Ullmann LS, Malossi CD, Miodutzki GT, da Silva EC, Machado EF, et al. A fast and cheap in-house magnetic bead RNA extraction method for COVID-19 diagnosis. J Virol Methods. 2022 Feb;300:114414.Amirouche A, Ait-Ali D, Nouri H, Boudrahme-Hannou L, Tliba S, Ghidouche A, et al. TRIzol-based RNA extraction for detection protocol for SARS-CoV-2 of coronavirus disease 2019. New Microbes New Infect. 2021 May;41:100874.Shen CH. Extraction and Purification of Nucleic Acids and Proteins. In: Diagnostic Molecular Biology. Elsevier; 2019. p. 143–66.TESENA P, KORCHUNJIT W, TAYLOR J, WONGTAWAN T. Comparison of commercial RNA extraction kits and qPCR master mixes for studying gene expression in small biopsy tissue samples from the equine gastric epithelium. J Equine Sci. 2017;28(4):135–41.Mallmann L, Hermann BS, Schallenberger K, Demoliner M, Eisen AKA, Heldt FH, et al. Proteinase K treatment in absence of RNA isolation classical procedures is a quick and cheaper alternative for SARS-CoV-2 molecular detection. J Virol Methods. 2021 Jul;293:114131.He H, Li R, Chen Y, Pan P, Tong W, Dong X, et al. Integrated DNA and RNA extraction using magnetic beads from viral pathogens causing acute respiratory infections. Sci Rep. 2017 Mar 23;7(1):45199.Reyes-Calderón A, Mindreau-Ganoza E, Pardo-Figueroa B, Garcia-Luquillas KR, Yufra SP, Romero PE, et al. Evaluation of low-cost SARS-CoV-2 RNA purification methods for viral quantification by RT-qPCR and next-generation sequencing analysis: Implications for wider wastewater-based epidemiology adoption. Heliyon. 2023 Jun;9(6):e16130.Lu Y, Sun Z. SARS-CoV-2 Molecular Diagnostics in China. Clin Lab Med. 2022 Jun;42(2):193–201.Palacio Rua K, García Correa JF, Aguilar-Jiménez W, Afanador Ayala C, Rugeles MT, Zuluaga AF. Validación de una técnica de PCR dúplex usando el gen E y RNasa P para el diagnóstico de SARS-CoV-2. 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