Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino
El cáncer de ovario es la séptima neoplasia maligna en Colombia y en el mundo, con un incremento en el porcentaje de muertes en mujeres de 45 a 50 años de acuerdo con el último reporte registrado por el sistema de información de cáncer - SICC (1). El diagnóstico de cáncer de ovario es uno de los más...
- Autores:
-
Ávila Torres, Ana María
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2018
- Institución:
- Colegio Mayor de Cundinamarca
- Repositorio:
- Repositorio Colegio Mayor de Cundinamarca
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.unicolmayor.edu.co:unicolmayor/4782
- Acceso en línea:
- https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/4782
- Palabra clave:
- Muertes en mujeres
Membrana celular
Células tumorales
Proteínas de choque térmico
Cáncer de ovario
Cisplatino
- Rights
- closedAccess
- License
- Derechos Reservados - Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, 2018
| id |
UCOLMAYOR2_844fa695c75ef9d5b5f0c4d1d363c367 |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.unicolmayor.edu.co:unicolmayor/4782 |
| network_acronym_str |
UCOLMAYOR2 |
| network_name_str |
Repositorio Colegio Mayor de Cundinamarca |
| repository_id_str |
|
| dc.title.spa.fl_str_mv |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino |
| title |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino |
| spellingShingle |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino Muertes en mujeres Membrana celular Células tumorales Proteínas de choque térmico Cáncer de ovario Cisplatino |
| title_short |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino |
| title_full |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino |
| title_fullStr |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino |
| title_full_unstemmed |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino |
| title_sort |
Determinación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con Cisplatino |
| dc.creator.fl_str_mv |
Ávila Torres, Ana María |
| dc.contributor.advisor.none.fl_str_mv |
Gutiérrez Castañeda, Luz Dary Sánchez Mora, Ruth Melida |
| dc.contributor.author.none.fl_str_mv |
Ávila Torres, Ana María |
| dc.subject.lemb.none.fl_str_mv |
Muertes en mujeres Membrana celular Células tumorales |
| topic |
Muertes en mujeres Membrana celular Células tumorales Proteínas de choque térmico Cáncer de ovario Cisplatino |
| dc.subject.proposal.spa.fl_str_mv |
Proteínas de choque térmico Cáncer de ovario Cisplatino |
| description |
El cáncer de ovario es la séptima neoplasia maligna en Colombia y en el mundo, con un incremento en el porcentaje de muertes en mujeres de 45 a 50 años de acuerdo con el último reporte registrado por el sistema de información de cáncer - SICC (1). El diagnóstico de cáncer de ovario es uno de los más difíciles debido a que las mujeres con cáncer en estadios I y II de la escala FIGO (Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia) no presentan ningún síntoma, razón por la cual, el diagnóstico de esta patología se realiza en estadios III y IV. El tratamiento en los estadios III y IV incluye una terapia combinada basada en compuestos platinos y taxanos. Sin embargo, aproximadamente del 10 al 15% de los pacientes hacen resistencia a esta quimioterapia (2). A partir del sexto al doceavo mes las pacientes hacen resistencia al cisplatino, lo que conduce a la muerte. La literatura internacional ha sugerido a las proteínas de choque térmico (HSP’s) como posibles causantes de la refractariedad a los fármacos. Las HSP’s son una familia de proteínas que cumplen funciones de chaperonas moleculares en la mayoría de procesos químicos y moleculares que realiza la célula (2). Por lo anterior el objetivo de este trabajo fue identificar si las proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 cambian su expresión intracelular y en la membrana celular de la línea celular MES-OV de cáncer de ovario y de origen humano al ser tratada a diferentes concentraciones de cisplatino. Para esto se usó epi-inmunofluorescencia directa y se identificó la expresión de las proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90. Se encontró que al tratar la línea celular MES-OV con concentraciones de 111.4µM, 148.6 µM, 185.8 µM de cisplatino la proteína Hsp70 intracelular aumenta del 61.9% al 100% y del 37% al 98% en membrana celular, también se encontró que la Hsp90 intracelular aumenta de 91.2% al 99.5%, sin embargo, en membrana se encontró que pasa de 59.5% a 8% al ser tratada con 111.4 µM, a 17.6% al ser tratada con 148.6 µM y a 63.2% al ser tratada con 185.8 µM decisplatino. Este hallazgo sugiere que las proteínas de choque térmico están involucradas en el mecanismo de adaptación y resistencia de las células tumorales al cisplatino. |
| publishDate |
2018 |
| dc.date.issued.none.fl_str_mv |
2018-11 |
| dc.date.accessioned.none.fl_str_mv |
2022-03-07T20:52:55Z |
| dc.date.available.none.fl_str_mv |
2022-03-07T20:52:55Z |
| dc.type.spa.fl_str_mv |
Trabajo de grado - Pregrado |
| dc.type.coar.spa.fl_str_mv |
http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f |
| dc.type.coarversion.spa.fl_str_mv |
http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85 |
| dc.type.content.spa.fl_str_mv |
Text |
| dc.type.driver.spa.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/bachelorThesis |
| dc.type.redcol.spa.fl_str_mv |
https://purl.org/redcol/resource_type/TP |
| dc.type.version.spa.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| format |
http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f |
| status_str |
publishedVersion |
| dc.identifier.uri.none.fl_str_mv |
https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/4782 |
| dc.identifier.barcode.none.fl_str_mv |
58657 |
| url |
https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/4782 |
| identifier_str_mv |
58657 |
| dc.language.iso.spa.fl_str_mv |
spa |
| language |
spa |
| dc.relation.references.spa.fl_str_mv |
Lucasian Labs S.A.S. y Alejandría Soluciones de Tecnología S.A.S. Sistema de Información de Cáncer en Colombia [Internet]. [Citado el 18 Junio 2018]. Disponible en: http://www.infocancer.co/portal/#!/home Piulats JM, Vidal A, García-Rodríguez FJ, Muñoz C, Nadal M, Moutinho C, et al. Orthoxenografts of testicular germ cell tumors demonstrate genomic changes associated with cisplatin resistance and identify PDMP as a re-sensitizing agent. [Internet]. 2018; clincanres.1898.2017. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29618620%0Ahttp://clincancerres.aacrjourn als.org/lookup/doi/10.1158/1078-0432.CCR-17-1898 Sociedad Americana de Cáncer. Acerca del cáncer de ovario [Internet]. Cancer.org. 2018 [citado 18 Julio 2018]. Disponible en: https://www.cancer.org/es/cancer/cancer-de-ovario/acerca.html Lema M. Carcinoma de ovario (C56X) [Internet]. Mauriciolema.webhost4life.com. 2018 [citado 24 Julio 2018]. Disponible en: http://mauriciolema.webhost4life.com/Protocolos QT/FichasTecnicas/C56X.do Garrido C, Gurbuxani S, Ravagnan L, Kroemer G. Heat shock proteins: Endogenous modulators of apoptotic cell death. Biochem Biophys Res Commun. 2001; 286(3):433–42. Rappa F, Farina F, Zummo G, David S, Campanella C, Carini F, et al. HSPMolecular chaperones in cancer biogenesis and tumor therapy: An overview. Anticancer Res. 2012; 32(12):5139–50. Alaiya A , Franzén B, Fujioka K, Moberger B, Schedvins K, Silfversvärd C, et al. Phenotypic analysis of ovarian carcinoma: polypeptide expression in benign, borderline and malignant tumors. 1997; 73(5):678–8 Luo LY, Herrera I, Soosaipillai A, Diamandis EP. Identification of heat shock protein 90 and other proteins as tumour antigens by serological screening of an ovarian carcinoma expression library. Br J Cancer. 2002; 87(3):339–43. . Elpek GÖ, Karaveli Ş, Şimşek T, Keleş N, Aksoy NH. Expression of heat-shock proteins hsp27, hsp70 and hsp90 in malignant epithelial tumour of the ovaries. Apmis. 2003; 111(4):523–30 Vidal CI, Mintz PJ, Lu K, Ellis LM, Manenti L, Giavazzi R, et al. An HSP90-mimic peptide revealed by fingerprinting the pool of antibodies from ovarian cancer patients. Oncogene. 2004; 23(55):8859–67. Chu SH, Liu YW, Zhang L, Liu B, Li L, Shi JZ. Regulation of survival and chemoresistance by HSP90AA1 in ovarian cancer SKOV3 cells. Mol Biol Rep. 2013; 40(1):1–6 Yang X, Wang J, Zhou Y, Wang Y, Wang S, Zhang W. Hsp70 promotes chemoresistance by blocking Bax mitochondrial translocation in ovarian cancer cells. Cancer Lett [Internet]. 2012; 321(2):137–43. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2012.01.030 Prat J, Committee F. International Journal of Gynecology and Obstetrics Staging classi fi cation for cancer of the ovary, fallopian tube , and peritoneum ☆ . Int J Gynecol Obstet [Internet]. 2013; 124:1–5. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijgo.2013.10.001 Lianos GD, Alexiou GA, Mangano A, Mangano A, Rausei S, Boni L, et al. The role of heat shock proteins in cancer. Cancer Lett [Internet]. 2015; 360(2):114–8. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2015.02.0 Carmelo, E. et al. (2006). Proteínas de choque térmico en parásitos: la Hsp70 y el sistema inmune. Revista Ibérica de Parasitología, 66(4), 39–46. Sharma, D. et al. (2009). Hsp70 structure, function, regulation and influence on yeast prions. Protein and Peptide Letters, 16(6), 571–581. https://doi.org/10.2174/092986609788490230 Sharma, D. et al. (2009). Hsp70 structure, function, regulation and influence on yeast prions. Protein and Peptide Letters, 16(6), 571–581. https://doi.org/10.2174/092986609788490230 Dasari S. et al. (2015). Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. Eur J Pharmacol, 5(0), 364–378. Dispobible en: https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2014.07.025.Cisplatin Cisplatino [Internet]. Oncohealth Institute. 2018 Disponible en: http://www.oncohealth.eu/es/area-paciente/cancer/informacion-soportepaciente/informacion-general/tratamiento/quimioterapia/listado-farmacos /cispla Gutierrez L et al.2018, Cultivo celular de la línea MES-OV. Invitrogen™ Molecular Probes™ MTT Cell Proliferation Assay Kit. Delgado N. [Internet]. Ucv.ve. 2018 [citado 26 Julio 2018]. Disponible en: http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Zoologia_Agricola/ Manejo_Integrado/Competencia3/Clase_practica_control_microbiologico_FMIIP_ 2016.pdf Vallespí M, García I2. Annu Rev Microbiol. Habana 2008; 25:10. Multhoff G. Heat shock protein 70 (Hsp70): Memb Schilling D, Gehrmann M, Steinem C, De Maio A, Pockley AG, Abend M, et al. Binding of heat shock protein 70 to extracellular phosphatidylserine promotes killing of normoxic and hypoxic tumor cells. FASEB J. 2009; 23(8):2467–77. Lancaster GI, Febbraio MA. Exosome-dependent trafficking of HSP70: A novel secretory pathway for cellular stress proteins. J Biol Chem. 2005 Multhoff G, Botzler C, Wiesnet M, Muller E, Meier T, Wilmanns W, et al. a stressinducible 72-kda heat-shock protein (hsp72) is expressed on the surface of human tumor cells, 1995; 279:272–9 Chen,B. The HSP90 family of genes in the human genome: insights into their divergence and evolution. Genomics 86, 627-637 (2005). [PubMed Chen,B. The HSP90 family of genes in the human genome: insights into their divergence and evolution. Genomics 86, 627-637 (2005). [PubMed Zhang Z, Xie Z, Sun G, Yang P, Li J, Yang H, et al. Reversing drug resistance of cisplatin by hsp90 inhibitors in human ovarian cancer cells. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(5):6687–701. Hahn JS. The Hsp90 chaperone machinery: From structure to drug development. BMB Rep. 2009; 42(10):623–3 Medicina FDE, Doctoral T. Celular En Cáncer De Ovario Y De. 2016 Perales Romero S. Proliferación y Apoptosis en celulas de musculo liso arteriales en cultivo. 2005. 243 p Shaloam Dasari and Paul Bernard Tchounwou. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. Eur J Pharmacol. 2015; 5(0):364–78. Canet Lorente B, Catasús Cols L. Papel de las RHO GTPasas en el carcinoma de ovario. 2014; Disponible en: https://ddd.uab.cat/record/117057 Powers M V., Clarke PA, Workman P. Death by chaperone: HSP90, HSP70 or both? Cell Cycle. 2009; 8(4):518–26. Nimmervoll B, Chtcheglova LA, Juhasz K, Cremades N, Aprile FA, Sonnleitner A, et al. Cell surface localised Hsp70 is a cancer specific regulator of clathrinindependent endocytosis. FEBS Lett [Internet]. 2015; 589(19):2747–53. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2015.07.037 Wong DS, Jay DG. Emerging Roles of Extracellular Hsp90 in Cancer [Internet]. 1ed. Vol. 129, Advances in Cancer Research. Elsevier Inc.; 2016. 141-163 p. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/bs.acr.2016.01.001 Benedet J.L., Bender H., Jones III H., Ngan H.Y.S PS. FIGO staging classifications and clinical practice gudelines in the management of gynecologic cancers. Int J Gynecol Obstet [Internet]. 2000; 70(2):209–62. Disponible en: http://doi.wiley.com/10.1016/S0020-7292%2800%2990001-8 Wong DS, Jay DG. Emerging Roles of Extracellular Hsp90 in Cancer [Internet]. 1st ed. Vol. 129, Advances in Cancer Research. Elsevier Inc.; 2016. 141-163 p. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/bs.acr.2016.01.001 . Kang H-J, Moon H-S, Chung H-W. The expression of FAS-associated factor 1 and heat shock protein 70 in ovarian cancer. Obstet Gynecol Sci. 2014;57(4):281–90. Jiang S, Tu K, Fu Q, Schmitt DC, Zhou L, Lu N, et al. Multifaceted roles of HSF1 in cancer. Tumor Biol. 2015; 36(7):4923–31. |
| dc.rights.spa.fl_str_mv |
Derechos Reservados - Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, 2018 |
| dc.rights.uri.spa.fl_str_mv |
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |
| dc.rights.accessrights.spa.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/closedAccess |
| dc.rights.creativecommons.spa.fl_str_mv |
Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0) |
| dc.rights.coar.spa.fl_str_mv |
http://purl.org/coar/access_right/c_14cb |
| rights_invalid_str_mv |
Derechos Reservados - Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, 2018 https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0) http://purl.org/coar/access_right/c_14cb |
| eu_rights_str_mv |
closedAccess |
| dc.format.extent.spa.fl_str_mv |
64p. |
| dc.format.mimetype.spa.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.publisher.spa.fl_str_mv |
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca |
| dc.publisher.faculty.spa.fl_str_mv |
Facultad de Ciencias de la Salud |
| dc.publisher.place.spa.fl_str_mv |
Bogotá D.C |
| dc.publisher.program.spa.fl_str_mv |
Bacteriología y Laboratorio Clínico |
| institution |
Colegio Mayor de Cundinamarca |
| bitstream.url.fl_str_mv |
https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/1/DETERMINACION%20DE%20PROTEINAS%20DE%20CHOQUE%20TERMICO%20HSP70%20Y%20HSP90%20EN%20LINEA%20CELULAR%20MES-OV%20TRATADA%20CON%20CI.pdf https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/2/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20.pdf https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/3/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20FORMATO%20DERECHOS%20DE%20AUTOR.pdf https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/4/license.txt https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/5/DETERMINACION%20DE%20PROTEINAS%20DE%20CHOQUE%20TERMICO%20HSP70%20Y%20HSP90%20EN%20LINEA%20CELULAR%20MES-OV%20TRATADA%20CON%20CI.pdf.txt https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/7/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20.pdf.txt https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/9/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20FORMATO%20DERECHOS%20DE%20AUTOR.pdf.txt https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/6/DETERMINACION%20DE%20PROTEINAS%20DE%20CHOQUE%20TERMICO%20HSP70%20Y%20HSP90%20EN%20LINEA%20CELULAR%20MES-OV%20TRATADA%20CON%20CI.pdf.jpg https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/8/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20.pdf.jpg https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/10/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20FORMATO%20DERECHOS%20DE%20AUTOR.pdf.jpg |
| bitstream.checksum.fl_str_mv |
82344694920612909475de6c15a93cda 4efd1bf28ed4b1e70bfa37bccd3a52f4 eae308ee3ec69ac8ff3ac7a2355fc58d 2f9959eaf5b71fae44bbf9ec84150c7a c57cbbe9968841cabdf97a0caa31401c c5e5637cd7facc60859e14d0e322729c ce17bbb4d4f1cbe9a2413e4ea88bb0b2 cd0510d978c383d98bc718ec6b880bc0 37df3559ff0dc5974564023525d8a083 e7428d37e5a45bdec9fddc402eb7fce8 |
| bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv |
MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 MD5 |
| repository.name.fl_str_mv |
Biblioteca Digital Unicolmayor |
| repository.mail.fl_str_mv |
repositorio@unicolmayor.edu.co |
| _version_ |
1812210034912788480 |
| spelling |
Gutiérrez Castañeda, Luz Dary3dc185dc305169c19168b1127cffe9c8Sánchez Mora, Ruth Melida166f302591d01453f1d13fdfdfc6358aÁvila Torres, Ana Maríad6ba1b77f83abf03fc14812ae09fac222022-03-07T20:52:55Z2022-03-07T20:52:55Z2018-11https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/478258657El cáncer de ovario es la séptima neoplasia maligna en Colombia y en el mundo, con un incremento en el porcentaje de muertes en mujeres de 45 a 50 años de acuerdo con el último reporte registrado por el sistema de información de cáncer - SICC (1). El diagnóstico de cáncer de ovario es uno de los más difíciles debido a que las mujeres con cáncer en estadios I y II de la escala FIGO (Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia) no presentan ningún síntoma, razón por la cual, el diagnóstico de esta patología se realiza en estadios III y IV. El tratamiento en los estadios III y IV incluye una terapia combinada basada en compuestos platinos y taxanos. Sin embargo, aproximadamente del 10 al 15% de los pacientes hacen resistencia a esta quimioterapia (2). A partir del sexto al doceavo mes las pacientes hacen resistencia al cisplatino, lo que conduce a la muerte. La literatura internacional ha sugerido a las proteínas de choque térmico (HSP’s) como posibles causantes de la refractariedad a los fármacos. Las HSP’s son una familia de proteínas que cumplen funciones de chaperonas moleculares en la mayoría de procesos químicos y moleculares que realiza la célula (2). Por lo anterior el objetivo de este trabajo fue identificar si las proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 cambian su expresión intracelular y en la membrana celular de la línea celular MES-OV de cáncer de ovario y de origen humano al ser tratada a diferentes concentraciones de cisplatino. Para esto se usó epi-inmunofluorescencia directa y se identificó la expresión de las proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90. Se encontró que al tratar la línea celular MES-OV con concentraciones de 111.4µM, 148.6 µM, 185.8 µM de cisplatino la proteína Hsp70 intracelular aumenta del 61.9% al 100% y del 37% al 98% en membrana celular, también se encontró que la Hsp90 intracelular aumenta de 91.2% al 99.5%, sin embargo, en membrana se encontró que pasa de 59.5% a 8% al ser tratada con 111.4 µM, a 17.6% al ser tratada con 148.6 µM y a 63.2% al ser tratada con 185.8 µM decisplatino. Este hallazgo sugiere que las proteínas de choque térmico están involucradas en el mecanismo de adaptación y resistencia de las células tumorales al cisplatino.1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES 3 3. MARCO TEÓRICO 6 3.1. Cáncer de ovario 6 3.2. Generalidades de las proteínas de choque térmico 11 3.3. Proteínas de choque térmico en cáncer 14 3.4. Cisplatino 3.4.1 Mecanismo de acción 16 3.4.2 Efectos colaterales del fármaco en la quimioterapia… 18 4. DISEÑO METODOLÓGICO… 19 4.1. Tipo de estudio 19 4.2. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS 4.2.1. Viabilidad celular con MTT 19 4.2.2. Determinación de dosis letales por método probit 21 4.2.3. Inmunofluorescencia directa 21 4.2.4. Detección de Apoptosis/Necrosis 23 4.2.5. TUNEL Alexa Fluor 647 24 4.3. Estadística 25 5. RESULTADOS 26 5.1 Cultivo de línea celular MES-OV 26 5.1. Ensayo de Viabilidad celular con MTT 26 5.2. Concentración de cisplatino utilizado para obtener dosis letales 25, 50 y 70 28 5.3 Determinación de proteínas de choque térmico medianteInmunofluorescencia directa 5.3.1. Determinación de Hsp70 al ser tratada con cisplatino 30 5.3.2. Determinación de Hsp90 al ser tratada con cisplatino 33 5.4. Identificación de señales de muerte de células MES-OV al ser tratadas con cisplatino 36 5.5. Cambios en la fragmentación del DNA de las células MES-OV (ATCC) al ser tratadas con cisplatino 38 6. DISCUSIÓN 39 7. CONCLUSIÓN 41 8. SUGERENCIAS 42 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOSPregradoBacteriólogo(a) y Laboratorista Clínico64p.application/pdfspaUniversidad Colegio Mayor de CundinamarcaFacultad de Ciencias de la SaludBogotá D.CBacteriología y Laboratorio ClínicoDerechos Reservados - Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, 2018https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/info:eu-repo/semantics/closedAccessAtribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)http://purl.org/coar/access_right/c_14cbDeterminación de proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 en línea celular mes-ov tratada con CisplatinoTrabajo de grado - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fhttp://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85Textinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttps://purl.org/redcol/resource_type/TPinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionLucasian Labs S.A.S. y Alejandría Soluciones de Tecnología S.A.S. Sistema de Información de Cáncer en Colombia [Internet]. [Citado el 18 Junio 2018]. Disponible en: http://www.infocancer.co/portal/#!/homePiulats JM, Vidal A, García-Rodríguez FJ, Muñoz C, Nadal M, Moutinho C, et al. Orthoxenografts of testicular germ cell tumors demonstrate genomic changes associated with cisplatin resistance and identify PDMP as a re-sensitizing agent. [Internet]. 2018; clincanres.1898.2017. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29618620%0Ahttp://clincancerres.aacrjourn als.org/lookup/doi/10.1158/1078-0432.CCR-17-1898Sociedad Americana de Cáncer. Acerca del cáncer de ovario [Internet]. Cancer.org. 2018 [citado 18 Julio 2018]. Disponible en: https://www.cancer.org/es/cancer/cancer-de-ovario/acerca.htmlLema M. Carcinoma de ovario (C56X) [Internet]. Mauriciolema.webhost4life.com. 2018 [citado 24 Julio 2018]. Disponible en: http://mauriciolema.webhost4life.com/Protocolos QT/FichasTecnicas/C56X.doGarrido C, Gurbuxani S, Ravagnan L, Kroemer G. Heat shock proteins: Endogenous modulators of apoptotic cell death. Biochem Biophys Res Commun. 2001; 286(3):433–42.Rappa F, Farina F, Zummo G, David S, Campanella C, Carini F, et al. HSPMolecular chaperones in cancer biogenesis and tumor therapy: An overview. Anticancer Res. 2012; 32(12):5139–50.Alaiya A , Franzén B, Fujioka K, Moberger B, Schedvins K, Silfversvärd C, et al. Phenotypic analysis of ovarian carcinoma: polypeptide expression in benign, borderline and malignant tumors. 1997; 73(5):678–8Luo LY, Herrera I, Soosaipillai A, Diamandis EP. Identification of heat shock protein 90 and other proteins as tumour antigens by serological screening of an ovarian carcinoma expression library. Br J Cancer. 2002; 87(3):339–43.. Elpek GÖ, Karaveli Ş, Şimşek T, Keleş N, Aksoy NH. Expression of heat-shock proteins hsp27, hsp70 and hsp90 in malignant epithelial tumour of the ovaries. Apmis. 2003; 111(4):523–30Vidal CI, Mintz PJ, Lu K, Ellis LM, Manenti L, Giavazzi R, et al. An HSP90-mimic peptide revealed by fingerprinting the pool of antibodies from ovarian cancer patients. Oncogene. 2004; 23(55):8859–67.Chu SH, Liu YW, Zhang L, Liu B, Li L, Shi JZ. Regulation of survival and chemoresistance by HSP90AA1 in ovarian cancer SKOV3 cells. Mol Biol Rep. 2013; 40(1):1–6Yang X, Wang J, Zhou Y, Wang Y, Wang S, Zhang W. Hsp70 promotes chemoresistance by blocking Bax mitochondrial translocation in ovarian cancer cells. Cancer Lett [Internet]. 2012; 321(2):137–43. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2012.01.030Prat J, Committee F. International Journal of Gynecology and Obstetrics Staging classi fi cation for cancer of the ovary, fallopian tube , and peritoneum ☆ . Int J Gynecol Obstet [Internet]. 2013; 124:1–5. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijgo.2013.10.001Lianos GD, Alexiou GA, Mangano A, Mangano A, Rausei S, Boni L, et al. The role of heat shock proteins in cancer. Cancer Lett [Internet]. 2015; 360(2):114–8. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2015.02.0Carmelo, E. et al. (2006). Proteínas de choque térmico en parásitos: la Hsp70 y el sistema inmune. Revista Ibérica de Parasitología, 66(4), 39–46.Sharma, D. et al. (2009). Hsp70 structure, function, regulation and influence on yeast prions. Protein and Peptide Letters, 16(6), 571–581. https://doi.org/10.2174/092986609788490230Sharma, D. et al. (2009). Hsp70 structure, function, regulation and influence on yeast prions. Protein and Peptide Letters, 16(6), 571–581. https://doi.org/10.2174/092986609788490230Dasari S. et al. (2015). Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. Eur J Pharmacol, 5(0), 364–378. Dispobible en: https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2014.07.025.CisplatinCisplatino [Internet]. Oncohealth Institute. 2018 Disponible en: http://www.oncohealth.eu/es/area-paciente/cancer/informacion-soportepaciente/informacion-general/tratamiento/quimioterapia/listado-farmacos /cisplaGutierrez L et al.2018, Cultivo celular de la línea MES-OV.Invitrogen™ Molecular Probes™ MTT Cell Proliferation Assay Kit.Delgado N. [Internet]. Ucv.ve. 2018 [citado 26 Julio 2018]. Disponible en: http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Zoologia_Agricola/ Manejo_Integrado/Competencia3/Clase_practica_control_microbiologico_FMIIP_ 2016.pdfVallespí M, García I2. Annu Rev Microbiol. Habana 2008; 25:10.Multhoff G. Heat shock protein 70 (Hsp70): MembSchilling D, Gehrmann M, Steinem C, De Maio A, Pockley AG, Abend M, et al. Binding of heat shock protein 70 to extracellular phosphatidylserine promotes killing of normoxic and hypoxic tumor cells. FASEB J. 2009; 23(8):2467–77.Lancaster GI, Febbraio MA. Exosome-dependent trafficking of HSP70: A novel secretory pathway for cellular stress proteins. J Biol Chem. 2005Multhoff G, Botzler C, Wiesnet M, Muller E, Meier T, Wilmanns W, et al. a stressinducible 72-kda heat-shock protein (hsp72) is expressed on the surface of human tumor cells, 1995; 279:272–9Chen,B. The HSP90 family of genes in the human genome: insights into their divergence and evolution. Genomics 86, 627-637 (2005). [PubMedChen,B. The HSP90 family of genes in the human genome: insights into their divergence and evolution. Genomics 86, 627-637 (2005). [PubMedZhang Z, Xie Z, Sun G, Yang P, Li J, Yang H, et al. Reversing drug resistance of cisplatin by hsp90 inhibitors in human ovarian cancer cells. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(5):6687–701.Hahn JS. The Hsp90 chaperone machinery: From structure to drug development. BMB Rep. 2009; 42(10):623–3Medicina FDE, Doctoral T. Celular En Cáncer De Ovario Y De. 2016Perales Romero S. Proliferación y Apoptosis en celulas de musculo liso arteriales en cultivo. 2005. 243 pShaloam Dasari and Paul Bernard Tchounwou. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. Eur J Pharmacol. 2015; 5(0):364–78.Canet Lorente B, Catasús Cols L. Papel de las RHO GTPasas en el carcinoma de ovario. 2014; Disponible en: https://ddd.uab.cat/record/117057Powers M V., Clarke PA, Workman P. Death by chaperone: HSP90, HSP70 or both? Cell Cycle. 2009; 8(4):518–26.Nimmervoll B, Chtcheglova LA, Juhasz K, Cremades N, Aprile FA, Sonnleitner A, et al. Cell surface localised Hsp70 is a cancer specific regulator of clathrinindependent endocytosis. FEBS Lett [Internet]. 2015; 589(19):2747–53. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2015.07.037Wong DS, Jay DG. Emerging Roles of Extracellular Hsp90 in Cancer [Internet]. 1ed. Vol. 129, Advances in Cancer Research. Elsevier Inc.; 2016. 141-163 p. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/bs.acr.2016.01.001Benedet J.L., Bender H., Jones III H., Ngan H.Y.S PS. FIGO staging classifications and clinical practice gudelines in the management of gynecologic cancers. Int J Gynecol Obstet [Internet]. 2000; 70(2):209–62. Disponible en: http://doi.wiley.com/10.1016/S0020-7292%2800%2990001-8Wong DS, Jay DG. Emerging Roles of Extracellular Hsp90 in Cancer [Internet]. 1st ed. Vol. 129, Advances in Cancer Research. Elsevier Inc.; 2016. 141-163 p. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/bs.acr.2016.01.001. Kang H-J, Moon H-S, Chung H-W. The expression of FAS-associated factor 1 and heat shock protein 70 in ovarian cancer. Obstet Gynecol Sci. 2014;57(4):281–90.Jiang S, Tu K, Fu Q, Schmitt DC, Zhou L, Lu N, et al. Multifaceted roles of HSF1 in cancer. Tumor Biol. 2015; 36(7):4923–31.Muertes en mujeresMembrana celularCélulas tumoralesProteínas de choque térmicoCáncer de ovarioCisplatinoORIGINALDETERMINACION DE PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSP70 Y HSP90 EN LINEA CELULAR MES-OV TRATADA CON CI.pdfDETERMINACION DE PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSP70 Y HSP90 EN LINEA CELULAR MES-OV TRATADA CON CI.pdfapplication/pdf3583016https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/1/DETERMINACION%20DE%20PROTEINAS%20DE%20CHOQUE%20TERMICO%20HSP70%20Y%20HSP90%20EN%20LINEA%20CELULAR%20MES-OV%20TRATADA%20CON%20CI.pdf82344694920612909475de6c15a93cdaMD51open accessDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con .pdfDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con .pdfapplication/pdf1716058https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/2/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20.pdf4efd1bf28ed4b1e70bfa37bccd3a52f4MD52open accessDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con FORMATO DERECHOS DE AUTOR.pdfDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con FORMATO DERECHOS DE AUTOR.pdfapplication/pdf271239https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/3/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20FORMATO%20DERECHOS%20DE%20AUTOR.pdfeae308ee3ec69ac8ff3ac7a2355fc58dMD53metadata only accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-814828https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/4/license.txt2f9959eaf5b71fae44bbf9ec84150c7aMD54open accessTEXTDETERMINACION DE PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSP70 Y HSP90 EN LINEA CELULAR MES-OV TRATADA CON CI.pdf.txtDETERMINACION DE PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSP70 Y HSP90 EN LINEA CELULAR MES-OV TRATADA CON CI.pdf.txtExtracted texttext/plain13945https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/5/DETERMINACION%20DE%20PROTEINAS%20DE%20CHOQUE%20TERMICO%20HSP70%20Y%20HSP90%20EN%20LINEA%20CELULAR%20MES-OV%20TRATADA%20CON%20CI.pdf.txtc57cbbe9968841cabdf97a0caa31401cMD55open accessDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con .pdf.txtDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con .pdf.txtExtracted texttext/plain79170https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/7/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20.pdf.txtc5e5637cd7facc60859e14d0e322729cMD57open accessDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con FORMATO DERECHOS DE AUTOR.pdf.txtDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con FORMATO DERECHOS DE AUTOR.pdf.txtExtracted texttext/plain4https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/9/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20FORMATO%20DERECHOS%20DE%20AUTOR.pdf.txtce17bbb4d4f1cbe9a2413e4ea88bb0b2MD59metadata only accessTHUMBNAILDETERMINACION DE PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSP70 Y HSP90 EN LINEA CELULAR MES-OV TRATADA CON CI.pdf.jpgDETERMINACION DE PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSP70 Y HSP90 EN LINEA CELULAR MES-OV TRATADA CON CI.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg10113https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/6/DETERMINACION%20DE%20PROTEINAS%20DE%20CHOQUE%20TERMICO%20HSP70%20Y%20HSP90%20EN%20LINEA%20CELULAR%20MES-OV%20TRATADA%20CON%20CI.pdf.jpgcd0510d978c383d98bc718ec6b880bc0MD56open accessDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con .pdf.jpgDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con .pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg7308https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/8/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20.pdf.jpg37df3559ff0dc5974564023525d8a083MD58open accessDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con FORMATO DERECHOS DE AUTOR.pdf.jpgDeterminación de proteinas de choque termico HSP70 y HSP90 en línea celular MES - OV tratado con FORMATO DERECHOS DE AUTOR.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg6602https://repositorio.unicolmayor.edu.co/bitstream/unicolmayor/4782/10/Determinaci%c3%b3n%20de%20proteinas%20de%20choque%20termico%20HSP70%20y%20HSP90%20en%20l%c3%adnea%20celular%20MES%20-%20OV%20tratado%20con%20FORMATO%20DERECHOS%20DE%20AUTOR.pdf.jpge7428d37e5a45bdec9fddc402eb7fce8MD510metadata only accessunicolmayor/4782oai:repositorio.unicolmayor.edu.co:unicolmayor/47822022-03-08 03:00:51.337An error occurred on the license name.|||https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/open accessBiblioteca Digital Unicolmayorrepositorio@unicolmayor.edu.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 |