Establecimiento en suspensión celular de thevetia peruviana, con proyección hacia la producción de metabolitos secundarios

Thevetia peruviana, conocida popularmente como adelfa amarilla, es un arbusto perteneciente a la familia Apocynaceae reconocido tradicionalmente como planta medicinal. Tiene efectos diuréticos, cardiotónicos y se emplea para curar edemas, sus hojas también purgantes y la corteza se utiliza como catá...

Full description

Autores:
SIGARROA RIECHE, ALINA KATIL
Tipo de recurso:
http://purl.org/coar/resource_type/c_baaf
Fecha de publicación:
2022
Institución:
Universidad Francisco de Paula Santander
Repositorio:
Repositorio Digital UFPS
Idioma:
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OAI Identifier:
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Acceso en línea:
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Palabra clave:
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description Thevetia peruviana, conocida popularmente como adelfa amarilla, es un arbusto perteneciente a la familia Apocynaceae reconocido tradicionalmente como planta medicinal. Tiene efectos diuréticos, cardiotónicos y se emplea para curar edemas, sus hojas también purgantes y la corteza se utiliza como catártico y febrífugo. El uso tradicional de la planta es de cuidado pues, si no se saben administrar las cantidades precisas, puede resultar tóxica y sus semillas son venenosas, abortivas y alterantes, por ello la opción más conveniente para su adecuado aprovechamiento es identificar y aislar los compuestos que confieren estas propiedades y posteriormente desarrollar aplicaciones industriales y farmacéuticas que permitan obtener el producto natural puro para su uso como medicamento. Los compuestos que confieren estas propiedades medicinales provienen del metabolismo secundario de las plantas. En T. peruviana han sido identificados antioxidantes, polifenoles y glucósidos de particular interés por sus beneficios para la salud, específicamente dos familias de glucósidos denominadas Thevetinas A y B han sido reportadas como aisladas de semillas, hojas y frutos de la planta pero, en general, las concentraciones halladas en plantas en estado natural son relativamente bajas, esto determina que para aplicaciones industriales, serían necesarias grandes cantidades de material vegetal para lograr la obtención de cantidades importantes de los metabolitos de interés, lo anterior supone, además de inconvenientes logísticos, una presión importante sobre las poblaciones naturales de esta especie. El uso de suspensiones celulares producidas “in vitro” se convierte en una alternativa de interés para dar una solución a esta problemática, poner a punto esta tecnología depende de estandarizar las condiciones iniciales para lograr cultivos celulares con crecimiento activo y adecuado comportamiento en condiciones de laboratorio garantizando alta productividad, aumento rápido de las células, estabilidad genética y control de la diferenciación celular. El estudio pretende evaluar las condiciones iniciales para establecer y cultivar células en suspensión de Thevetia peruviana en el laboratorio de biotecnología vegetal de la UFPS con proyección hacia la producción de metabolitos secundarios, para ello se han planteado 3 objetivos específicos: Evaluar los parámetros de cultivo (tipo de explante, tipo y concentración de la fuente de C y niveles hormonales) para obtener inóculo de calidad para el establecimiento de las suspensiones celulares; establecer los parámetros idóneos de cultivo, a nivel matraz, para un adecuado crecimiento celular y evaluar la dinámica de crecimiento y los parámetros de calidad de la suspensión celular bajo las condiciones de cultivo en estudio. Con una metodología de trabajo por etapas sucesivas, primero se determinan condiciones ideales para lograr establecer callos friables con los cuales obtener el inóculo inicial, posteriormente serán evaluados parámetros de cultivo por medio de un seguimiento a las dinámicas de crecimiento celular y evaluación a la calidad de estas suspensiones celulares. Los resultados del estudio serán punto de partida para posteriormente identificar compuestos metabólicos de interés y trabajar en el diseño del bioproceso, construyendo conocimiento que permita, a futuro, diseñar un bioproceso eficiente que logre obtener cantidades importantes de células productoras de algunos de los metabolitos de interés industrial que posee la planta.
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Los compuestos que confieren estas propiedades medicinales provienen del metabolismo secundario de las plantas. En T. peruviana han sido identificados antioxidantes, polifenoles y glucósidos de particular interés por sus beneficios para la salud, específicamente dos familias de glucósidos denominadas Thevetinas A y B han sido reportadas como aisladas de semillas, hojas y frutos de la planta pero, en general, las concentraciones halladas en plantas en estado natural son relativamente bajas, esto determina que para aplicaciones industriales, serían necesarias grandes cantidades de material vegetal para lograr la obtención de cantidades importantes de los metabolitos de interés, lo anterior supone, además de inconvenientes logísticos, una presión importante sobre las poblaciones naturales de esta especie. El uso de suspensiones celulares producidas “in vitro” se convierte en una alternativa de interés para dar una solución a esta problemática, poner a punto esta tecnología depende de estandarizar las condiciones iniciales para lograr cultivos celulares con crecimiento activo y adecuado comportamiento en condiciones de laboratorio garantizando alta productividad, aumento rápido de las células, estabilidad genética y control de la diferenciación celular. El estudio pretende evaluar las condiciones iniciales para establecer y cultivar células en suspensión de Thevetia peruviana en el laboratorio de biotecnología vegetal de la UFPS con proyección hacia la producción de metabolitos secundarios, para ello se han planteado 3 objetivos específicos: Evaluar los parámetros de cultivo (tipo de explante, tipo y concentración de la fuente de C y niveles hormonales) para obtener inóculo de calidad para el establecimiento de las suspensiones celulares; establecer los parámetros idóneos de cultivo, a nivel matraz, para un adecuado crecimiento celular y evaluar la dinámica de crecimiento y los parámetros de calidad de la suspensión celular bajo las condiciones de cultivo en estudio. Con una metodología de trabajo por etapas sucesivas, primero se determinan condiciones ideales para lograr establecer callos friables con los cuales obtener el inóculo inicial, posteriormente serán evaluados parámetros de cultivo por medio de un seguimiento a las dinámicas de crecimiento celular y evaluación a la calidad de estas suspensiones celulares. Los resultados del estudio serán punto de partida para posteriormente identificar compuestos metabólicos de interés y trabajar en el diseño del bioproceso, construyendo conocimiento que permita, a futuro, diseñar un bioproceso eficiente que logre obtener cantidades importantes de células productoras de algunos de los metabolitos de interés industrial que posee la planta.Esta propuesta de investigación se ubica dentro del paradigma cuantitativo, siendo una investigación aplicada puesto que utiliza los conocimientos y saberes para la resolución práctica de problemas, con metodología analítica dado que parte de ciertas hipótesis y busca comprobarlas o refutarlas, mediante la aplicación de los conocimientos teóricos a casos tipo o a escenarios experimentales controlados, para así poder establecer la relación entre un conjunto de variables y un conjunto de resultados. Es de tipo experimental en la medida que replica, bajo ambientes controlados, fenómenos naturales, buscando poder comprender el modo en que ocurren y los factores que intervienen en él, obteniendo resultados predecibles o medibles. Población: Plantas de Thevetia peruviana ubicadas en la ciudad de Cúcuta y Paz de Ariporo, Casanare. Muestra: de tipo aleatorio consistente en frutos y hojas de T. peruviana HIPÓTESIS H1: Es posible establecer suspensiones celulares de T. peruviana cuya calidad es dependiente de parámetros de cultivo tales como la fuente y tipo de explante, de la fuente de C y su concentración, así como del tipo y nivel de hormonas presentes en el medio. H0: No es posible establecer suspensiones celulares de T. peruviana con calidad dependiente de parámetros de cultivo tales como la fuente y tipo de explante, de la fuente de C y su concentración, así como del tipo y nivel de hormonas presentes en el medio. Se definen variables independientes, dependientes e intervinientes por cada fase de la investigación. FASES DE LA INVESTIGACIÓN FASE 1. OBTENCIÓN DEL INÓCULO Se establece un diseño experimental completamente aleatorizado para evaluar los parámetros de cultivo para obtener el inóculo de calidad para establecer las suspensiones celulares. Variables Independientes: Explante (Dos niveles: Fragmentos de fruto y hojas) Concentración de fuente de Carbono (Dos niveles: Sacarosa 30 g/L y 40 g/L) Hormonas Vegetales: (Dos niveles: 2,4 D y Auxina/Citoquinina rel 1:1) Tratamientos: 8 Repeticiones/tratamiento: 10 Total de unidades experimentales: 80 Evaluación Semanal de variables dependientes Variables Dependientes: Contaminación Endógena Fenolización Formación de callo (Tamaño, textura, cubrimiento) Descripción: Material Vegetal: Fragmentos de frutos y hojas de T. peruviana Desinfección de material Vegetal: Frutos: Se seguirá el protocolo propuesto por Arias, 2013. Hojas: Fragmentos de hojas serán sometidos a lavado con agua y detergente por 5 minutos, seguido de un lavado con agua de chorro, inmersión en alcohol al 70 % por 1 minuto, posterior lavado con agua destilada estéril y finalmente inmersión por 5 minutos en hipoclorito de sodio al 6 % con tres lavados con agua destilada estéril. Medios de cultivo: Se establecen los explantes en medio basal SH modificados en concentración de sacarosa (30 y 40 g/L) y con adición de dos fuentes hormonales H-1: 2,4 D 2 mg/L + 0,5 mg/L Kinetina H-2: 2,4 D 3 mg/L FASE 2. ESTABLECIMIENTO DE SUSPENSIONES CELULARES A NIVEL DE MATRACES Etapa de desagregación celular: Los fragmentos de callos friables obtenidos serán transferidos a medio líquido SH en agitación e incubados a 23-25 0C en condiciones de oscuridad completa para lograr la separación de las células. Posteriormente serán tamizadas las soluciones conteniendo fragmentos de callos, agregados celulares grandes, pequeños y células aisladas y filtradas para lograr la separación de agregados celulares pequeños y células aisladas que serán el inóculo inicial para establecer las suspensiones celulares. Se hará ajuste de concentración inicial de inóculo para cada tratamiento y se establece la suspensión en un medio líquido SH al 100 % con dos niveles de relación hormonal. Las suspensiones se mantendrán a 23-25°C, en constante agitación (150 rpm) y bajo condiciones de oscuridad hasta alcanzar la máxima concentración celular. Diseño completamente aleatorizado con dos variables independientes de dos niveles cada una. 4 repeticiones. Total de 4 tratamientos para 16 unidades experimentales. Unidad experimental: Erlenmeyer de 300-500 mL Variables Independientes: Concentración Inóculo inicial: 2 niveles (1,5 x 103 cel/mL y 1,5 x 105 cel/ml) Relación hormonal: 2 niveles (2:1 Cit/Aux y 1:2 Cit/Aux) FASE 2A. SEGUIMIENTO A LA DINÁMICA DE CRECIMIENTO CELULAR Y PRUEBAS DE CALIDAD A LAS SUSPENSIONES CELULARES OBTENIDAS Se hará seguimiento diario de concentración por peso fresco y peso seco para elaborar las curvas de crecimiento para cada tratamiento. Al alcanzar la máxima concentración (final de la fase de crecimiento exponencial) se harán pruebas completas de calidad (viabilidad y morfología) Viabilidad: Tinción con FDA Morfología: Descripción morfológica de tamaño y forma y tipo de células con ayuda de microscopio óptico. Como instrumentos se empleará la observación directa, las tablas de registro y el diseño experimental. Para la recolección de datos se elaborarán tablas y gráficas que permitan recolectar la información de las variables dependientes en cada fase de la investigación. Se tomarán fotografías para recolección de datos de morfología y viabilidad celular. Los parámetros cuantitativos serán sometidos a procesamiento estadístico para hallar promedios, analizar varianza y establecer diferencias entre los tratamientos.Biotecnología Verdeapplication/pdfspaEstablecimiento en suspensión celular de thevetia peruviana, con proyección hacia la producción de metabolitos secundariosPropuesta de investigaciónhttp://purl.org/coar/resource_type/c_baafhttp://purl.org/coar/resource_type/c_8042Textinfo:eu-repo/semantics/workingPaperhttps://purl.org/redcol/resource_type/WPinfo:eu-repo/semantics/drafthttp://purl.org/coar/version/c_b1a7d7d4d402bcce2022-11-08/2023-11-08info:eu-repo/semantics/closedAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_14cbArias Echeverri, J. (2013). 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Obtenido de: https://www.ica.gov.co/getattachment/9dcebd6e-3a0c-48a7-85d7-f01382635ed8/2003L811.aspxInstituto Colombiano, Agropecuario Documento Conpes 3527 sobre la política nacional de competitividad y productividad. (junio 23 de 2008). Obtenido de: https://www.ica.gov.co/getattachment/9ead52fd-f432-4175-b42a-484ea0662194/2008cn3527.aspxKamenova, K. C. (2019). TRABAJO FIN DE GRADO EL CULTIVO IN VITRO COMO FUENTE DE PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Obtenido de: http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/KRISTIN%20CHAVDAROVA%20KAMENOVA.pdfKumar, P., Atreya, A. & Kanchan, T. (2015). Thevetia peruviana. Medicina ambiental y de áreas silvestres, 26 (4), 590–591. https://doi.org/10.1016/j.wem.2015.07.007Mendoza Meza, D. (2019). Estudio metabolómico de células de Thevetia peruviana (Pers.) K. Schum. cultivadas en suspensión, como respuesta al tratamiento con dos elicitores de la biosíntesis de compuestos fenólicos.Mendoza, D., Cuaspud, O., Arias, J. P., Ruiz, O., & Arias, M. (2018). 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Revista de investigación farmacéutica, 4 (12), 4461-446425000000019-2022Establecimiento en suspensión celular de thevetia peruviana, con proyección hacia la producción de metabolitos secundarios87000000Programa Nacional en Ciencias AgropecuariasORIGINALMetabolitos Formato FINU 2022 (1).pdfMetabolitos Formato FINU 2022 (1).pdfapplication/pdf697939https://repositorio.ufps.edu.co/bitstream/ufps/6670/1/Metabolitos%20Formato%20FINU%202022%20%281%29.pdfab2ecb13fda7016f3158fe6545790503MD51metadata only accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-814828https://repositorio.ufps.edu.co/bitstream/ufps/6670/2/license.txt2f9959eaf5b71fae44bbf9ec84150c7aMD52open accessTEXTMetabolitos Formato FINU 2022 (1).pdf.txtMetabolitos Formato FINU 2022 (1).pdf.txtExtracted texttext/plain91833https://repositorio.ufps.edu.co/bitstream/ufps/6670/3/Metabolitos%20Formato%20FINU%202022%20%281%29.pdf.txt2c69c3e8a5bb7522a07d4ac47ef02bd5MD53open accessTHUMBNAILMetabolitos Formato FINU 2022 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