Diseño y Evaluación de Oligonucleótidos Para el Clonaje de un Fragmento de ADN Asociado con Lipasas Extracelulares de Candida palmioleophila en el Vector de Expresión pKLAC2
Digital
- Autores:
-
Rojas-Pérez, Juan David
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2023
- Institución:
- Universidad de Santander
- Repositorio:
- Repositorio Universidad de Santander
- Idioma:
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- OAI Identifier:
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Para lograr esto, se realizó el diseño de oligonucleótidos que permitan la amplificación del fragmento de interés en este caso un segmento denominado Secuencia 8 (Sec8). Los oligonucleótidos se evaluaron para identificar la especificidad de la amplificación y luego ser usados para reacción en cadena de la polimerasa (RCP) convencional. Se observo una correcta amplificación permitiendo confirmar, que los oligonucleótidos diseñados eran funcionales, así mismo se dio una correcta escisión por parte de las enzimas en el plásmido y en la secuencia, sin embargo, no se logró evidenciar la inserción del fragmento amplificado en el vector de expresión. Aunque no se obtuvieron clones con la secuencia esperada, este trabajo permitió identificar que los oligonucleótidos diseñados permiten la amplificación del fragmento de ADN de la lipasa Seq8.Candida palmioleophila (C. palmioleophila) is a yeast with potential for lipase production. Some genes encoding proteins with lipolytic activity has been studied in this yeast, however, to date only one has been expressed, corresponding to a protein of about 27 KDa. The aim of this work is to design oligonucleotides that allow the amplification of a DNA sequence associated with extracellular lipases of C. palmioleophila for insertion into expression vectors. To achieve this, we designed oligonucleotides that allow the amplification of the fragment of interest, in this case a segment called Sequence 8 (Sec8). The oligonucleotides were evaluated to identify the specificity of amplification and then used for conventional polymerase chain reaction (PCR). A correct amplification was observed, confirming that the designed oligonucleotides were functional, as well as a correct excision by the enzymes in the plasmid and in the sequence; however, the insertion of the amplified fragment in the expression vector was not evidenced. Although clones with the expected sequence were not obtained, this work allowed identifying that the designed oligonucleotides allow the amplification of the Seq8 lipase DNA fragment.PregradoMicrobiólogo IndustrialResumen ........................................................................................................................................ 13 Introducción .................................................................................................................................. 17 Planteamiento Problema ............................................................................................................... 18 Justificación .................................................................................................................................. 20 Objetivos ....................................................................................................................................... 25 Objetivo General ........................................................................................................................... 25 Objetivos Específicos.................................................................................................................... 25 Marco Teórico ............................................................................................................................... 26 Candida palmioleophila y su Potencial Biotecnológico ............................................................... 26 Lipasas Producidas por Microorganismos .................................................................................... 28 Aplicación Industrial de las Lipasas ............................................................................................. 29 Diseño de Oligonucleótidos .......................................................................................................... 31 Sistemas de Clonaje y sus Ventajas .............................................................................................. 33 Vector pKLAC2 ............................................................................................................................ 34 Metodología .................................................................................................................................. 37 Diseño de Oligonucleótidos y Análisis de Secuencia. .................................................................. 37 Microorganismos y Condiciones de Cultivo................................................................................. 38 Extracción de ADN Genómico y ADN Plasmídico ...................................................................... 39 Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP). .............................................................................. 41 Purificación de Fragmentos de RCP y Tratamiento con Enzimas de Restricción ........................ 42 Clonaje del Fragmento Seq8 en el Vector de Expresión pKLAC2 .............................................. 43 Transformación de Células de E. coli TOP10 Químicamente Competentes ................................ 44 Resultados y Discusión ................................................................................................................. 46 Diseño de oligonucleótidos para el clonaje de secuencias de lipasa. ........................................... 46 Microorganismos y Condiciones de Cultivo................................................................................. 46 Extracción de ADN Genómico (ADNg) y ADN Plasmídico (ADNp) ......................................... 48 Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP). .............................................................................. 50 Purificación de Fragmentos de RCP y Tratamiento con Enzimas de Restricción. ....................... 51 Clonaje del Fragmento Sec8 en el Vector de Expresión pKLAC2 ............................................... 53 Reacción de Ligación y Verificación del Clonaje. ....................................................................... 54 Conclusiones ................................................................................................................................. 57 Recomendaciones ......................................................................................................................... 58 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 59 Apéndices ...................................................................................................................................... 6672 papplication/pdfUniversidad de SantanderT 33.23 R641dRepositorio Digital Universidad de Santanderhttps://repositorio.udes.edu.cohttps://repositorio.udes.edu.co/handle/001/9238spaUniversidad de SantanderBucaramangaFacultad de Ciencias NaturalesBucaramanga, ColombiaMicrobiología IndustrialAcevedo Castro, M. 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Al consultar y hacer uso de este recurso, está aceptando las condiciones de uso establecidas por los autores.info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/C.palmioleophilaEscherichia coliClonaciónPlásmidoOligonucleótidosLipasaspKLAC2C.palmiolephilaEscherichia coliClonaciónPlásmidoOligonucleótidosLipasaspKLAC2CloningPlasmidOligonucleotidesDiseño y Evaluación de Oligonucleótidos Para el Clonaje de un Fragmento de ADN Asociado con Lipasas Extracelulares de Candida palmioleophila en el Vector de Expresión pKLAC2Design and Evaluation of Oligonucleotides for Cloning of a DNA Fragment Associated With Extracellular Lipases From Candida palmioleophila Into the Expression Vector pKLAC2Trabajo de grado - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fhttp://purl.org/coar/version/c_71e4c1898caa6e32Textinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttp://purl.org/redcol/resource_type/TPinfo:eu-repo/semantics/submittedVersionTodas las AudienciasPublicationLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-815543https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/e55361c6-892b-4428-aa25-0143a09abcdf/download73a5432e0b76442b22b026844140d683MD51ORIGINALLabel.pngLabel.pngimage/png155288https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/2156e85f-e25d-49be-a04d-3efdb006e5e3/download58596083eff60f1dfc06fab771f6ed5cMD57Diseño_y_Evaluación_de_Oligonucleótidos_Para_el_Clonaje_de_un_Fragmento_de_ADN_Asociado_con_Lipasas_Extracelulares_de_Candida_palmioleophila_en_el_Vector_de_Expresión_pKLAC2..pdfDiseño_y_Evaluación_de_Oligonucleótidos_Para_el_Clonaje_de_un_Fragmento_de_ADN_Asociado_con_Lipasas_Extracelulares_de_Candida_palmioleophila_en_el_Vector_de_Expresión_pKLAC2..pdfapplication/pdf1104277https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/4811bad3-d73e-4be1-bd7f-9cc1a66839c4/downloaddaa096e2764f8cf3055a0f211a6d9fc1MD58Informe de Prueba de Similitud Juan David Rojas.pdfInforme de Prueba de Similitud Juan David Rojas.pdfapplication/pdf31739https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/de392d68-116c-45e6-9aff-c534e18a7d38/downloadead37006af13298ec609ab30d48a1393MD55THUMBNAILLabel.png.jpgLabel.png.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg10262https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/764fc117-daea-4a7e-a847-3bffee72ec12/download7c173102685246bdc18759272213efe9MD59Diseño_y_Evaluación_de_Oligonucleótidos_Para_el_Clonaje_de_un_Fragmento_de_ADN_Asociado_con_Lipasas_Extracelulares_de_Candida_palmioleophila_en_el_Vector_de_Expresión_pKLAC2..pdf.jpgDiseño_y_Evaluación_de_Oligonucleótidos_Para_el_Clonaje_de_un_Fragmento_de_ADN_Asociado_con_Lipasas_Extracelulares_de_Candida_palmioleophila_en_el_Vector_de_Expresión_pKLAC2..pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg7624https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/4283a9d8-224b-46fa-9f59-7921e1bbc5a4/download196784ec5add24a952f7e81678a7d4dfMD511Informe de Prueba de Similitud Juan David Rojas.pdf.jpgInforme de Prueba de Similitud Juan David Rojas.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg8945https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/c4faf345-8109-4769-88e3-77cda62ce358/download6c3c2daf35ae87f24f897e2802d31ae1MD513TEXTDiseño_y_Evaluación_de_Oligonucleótidos_Para_el_Clonaje_de_un_Fragmento_de_ADN_Asociado_con_Lipasas_Extracelulares_de_Candida_palmioleophila_en_el_Vector_de_Expresión_pKLAC2..pdf.txtDiseño_y_Evaluación_de_Oligonucleótidos_Para_el_Clonaje_de_un_Fragmento_de_ADN_Asociado_con_Lipasas_Extracelulares_de_Candida_palmioleophila_en_el_Vector_de_Expresión_pKLAC2..pdf.txtExtracted texttext/plain101824https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/909831b8-7e6f-4bf5-b207-9eabad627882/downloadf55e1807f1e94bdfdbc2ec172ddd556aMD510Informe de Prueba de Similitud Juan David Rojas.pdf.txtInforme de Prueba de Similitud Juan David Rojas.pdf.txtExtracted texttext/plain818https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/72761d33-11ee-40ce-928f-80e82f7d1ace/download96421f88633e564ef2e84eb6990a6fd5MD512001/9238oai:repositorio.udes.edu.co:001/92382023-09-20 03:00:35.227https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Derechos Reservados - Universidad de Santander, 2023. 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