Estudio de los Niveles de Expresión de Genes Asociados a Lipasas Extracelulares en Cultivos de Candida palmioleophila Suplementados con Aceite de Oliva Como Única Fuente de Carbono
Digital
- Autores:
-
Farelo-Traslaviña, Laura Cristina
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2022
- Institución:
- Universidad de Santander
- Repositorio:
- Repositorio Universidad de Santander
- Idioma:
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- OAI Identifier:
- oai:repositorio.udes.edu.co:001/7312
- Acceso en línea:
- https://repositorio.udes.edu.co/handle/001/7312
- Palabra clave:
- C. Palmioleophila
Lipasas
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- Derechos Reservados - Universidad de Santander, 2022
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La evaluación de la expresión de genes asociados a lipasas extracelulares en C. palmioleophila puede contribuir con la identificación de la intervención de los genes asociados en los procesos de degradación metabólica de lípidos por técnicas como RT-qPCR. Para ello, se requiere del diseño de oligonucleótidos que permitan la amplificación de genes utilizados como normalizadores y genes candidatos a lipasas. El presente trabajo muestra el diseño y evaluación de 13 parejas de oligonucleótidos para genes reportados como lipasas y para genes reportados como normalizadores y el estudio de expresión de los genes lipasa en C. palmioleophila frente a condiciones inductoras de la actividad lipasa. Para este fin se diseñaron 4 parejas de oligonucleótidos específicos para cada gen y se evaluó su amplificación a partir de ADN genómico (ADNg) y ADN complementario (ADNc). Para realizar una aproximación a la estabilidad de la expresión de los genes de interés se utilizó el algoritmo GNORM. Se observó mayor expresión de la secuencia identificada como LipIII cuando la levadura fue expuesta a medios de cultivo con aceite de oliva como fuente de carbono. Los resultados obtenidos favorecen el estudio de la expresión génica en el entendimiento de la maquinaria metabólica que utiliza C. palmioleophila en la utilización de lípidos y abre la puerta para su uso en la evaluación de otras rutas metabólicas de interés.The interest in the biotechnological production of lipases lies in their various applications such as the synthesis of esters, hydrolysis of fats for the manufacture of detergents, production of biofuels, among others (Burkert, et al. 2004, Aceves, 2012). It is known that the yeast Candida palmioleophila has the capacity to assimilate derivatives of palm oil refining (Agualimpia, et al. 2016), and although profiles of extracellular proteins related to this activity have been described, the specific genes involved in this activity are not known. The evaluation of the expression of genes associated with extracellular lipases in C. palmioleophila by techniques such as RT-qPCR can contribute to the identification of the intervention of associated genes in the processes of metabolic degradation of lipids. For this, the design of oligonucleotides that allow the amplification of genes used as normalizers and candidate genes for lipases is required. The present work shows the design and evaluation of 13 pairs of oligonucleotides for genes reported as lipases and for genes reported as normalizers and the study of expression of lipase genes in C. palmioleophila against conditions that induce lipase activity. For this purpose, specific oligonucleotides were designed and their amplification capacity from genomic DNA (gDNA) and complementary DNA (cDNA) was evaluated. To make an approximation to the stability of the expression of the genes of interest, the GNORM algorithm was used. Higher expression of the sequence identified as LipIII was observed when the yeast was exposed to culture media with olive oil as carbon source. The results obtained favor the study of gene expression in the understanding of the metabolic machinery used by C. palmioleophila in the utilization of lipids and open the door for its use in the evaluation of other metabolic pathways of interest.PregradoMicrobiólogo IndustrialIntroducción .................................................................................................................................. 14 1. Planteamiento Problema ................................................................................................. 16 2. Justificación .................................................................................................................... 19 3. Objetivos ......................................................................................................................... 22 3.1 Objetivo General............................................................................................................. 22 3.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 22 4. Marco Teórico ................................................................................................................ 23 4.1 Descripción de las Lipasas e Interés en la Industria ....................................................... 23 4.2 Microorganismos Productores de Lipasas ...................................................................... 23 4.3 Lipasas en el Género Candida ........................................................................................ 24 4.4 Candida palmioleophila ................................................................................................. 25 4.5 Análisis de Expresión Génica ......................................................................................... 27 4.6 Análisis de Expresión Relativa por RT-qPCR................................................................ 27 5. Metodología .................................................................................................................... 30 5.1 Cultivo y Mantenimiento de Candida palmioleophila ................................................... 30 5.2 Evaluación del Crecimiento de C. palmioleophila. ........................................................ 30 5.3 Extracción de ARN Total ............................................................................................... 31 5.4 Diseño y Evaluación de Oligonucleótidos...................................................................... 31 5.5 Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP)................................... 32 5.6 Secuenciación de Fragmentos de ADN Obtenidos por RCP .......................................... 33 5.7 Extracción de ARN Total de C. palmioleophila............................................................. 34 5.8 Obtención de ADNc por Retro Transcripción ................................................................ 34 5.9 RCP en Tiempo Real (qPCR) ......................................................................................... 35 5.10 Evaluación de Genes Candidatos a Normalizadores ...................................................... 36 5.11 Aproximación al Análisis de Expresión Relativa ........................................................... 36 6. Resultados y Discusión ................................................................................................... 38 6.1 Microorganismos y Manipulación .................................................................................. 38 6.2 Crecimiento de C. palmioleophila con Fuentes de Carbono Oleosas ............................ 39 6.3 Diseño y Evaluación de Oligonucleótidos...................................................................... 41 6.4 Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP)................................... 42 6.5 Amplificación por qPCR ................................................................................................ 47 6.6 Aproximación a la Estabilidad de Genes Normalizadores ............................................. 50 6.7 Aproximación al Análisis de Expresión Génica ............................................................. 52 7. Conclusiones ................................................................................................................... 55 8. Recomendaciones ........................................................................................................... 56 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 5765 papplication/pdfT 33.22 F172ehttps://repositorio.udes.edu.co/handle/001/7312spaFacultad de Ciencias Exactas, Naturales y AgropecuariasBucaramanga, ColombiaMicrobiología IndustrialDerechos Reservados - Universidad de Santander, 2022info:eu-repo/semantics/openAccessAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/http://purl.org/coar/access_right/c_abf2C. PalmioleophilaLipasasExpresión génicaRT-qPCRGen más expresadoLipasesGene expressionNormalizing genesEstudio de los Niveles de Expresión de Genes Asociados a Lipasas Extracelulares en Cultivos de Candida palmioleophila Suplementados con Aceite de Oliva Como Única Fuente de CarbonoTrabajo de grado - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTextinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttps://purl.org/redcol/resource_type/TPhttp://purl.org/coar/version/c_71e4c1898caa6e32Todas las AudienciasAceves, A. (2012). Producción Biotecnológica de Lipasas Microbianas, una alternativa sostenible para la utilización de residuos agroindustriales. Vitae,19(3), undefined-undefined. https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=1698/169825291001Agualimpia B., Otero J., Zafra G. (2016), Evaluation of native microorganisms for biodegradation of oil and grease in palm oil refinery effluents, Biotecnol. Aplicada, 33(1), 1221-1226.Arroyo, M., Quesada, M., Quesada, R. (2008). 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