Evaluación de nuevas sondas de oligonucleótidos para la detección de bacterias sulfato reductoras

86 p

Autores:: Sanmiguel Tarazona, María Angélica

Tipo de recurso:: Trabajo de grado de pregrado

Fecha de publicación:: 2018

Institución:: Universidad de Santander

Repositorio:: Repositorio Universidad de Santander

Idioma:: spa

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spelling	Valdivieso Quintero, Wilfredo8a364218-619a-4695-a854-44b943784e23-1Sanmiguel Tarazona, María Angélica2a2599e3-639d-4ff6-9e0d-0ce20f5f34d2-12020-01-22T19:57:39Z2020-01-22T19:57:39Z2018-07-1686 pSulfate reducing bacteria are the main cause of corrosion induced by microorganisms in the oil industry because they generate sulfide acid and thus are affected structures, equipment and machinery of metal, as well as crude causing damage and economic losses. The enzyme responsible for the reduction of sulfate disassimilation is encoded by different genes, including the most studied gene dsrA, used for the detection and quantification of these bacteria. In this work, was standardized the polymerase chain reaction (PCR) technique for the detection of the DsrA gene, using new oligonucleotides previously designed by the young investigator Karen Angarita. For this, an analysis was made "in silico" of the control oligonucleotides and the oligonucleotides with potential to amplify the gene of interest, three different polymerases were evaluated, and the respective detection limits were determined. The amplified products were analyzed using agarose gels at 1.5%. The genomic DNA of Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579) was used as a positive control. The results show that the oligonucleotides designed have the potential to be used to detect sulfate reducing bacteria, since they showed no DNA amplification of other possible bacteria present in samples of interest in the industry Oil and with a detection limit of 1×10−5 ng of Desulfovibrio vulgaris DNA.Las bacterias sulfato reductoras son las principales causantes de la corrosión inducida por microorganismos en la industria petrolera debido a que generan ácido sulfhídrico y de este modo se ven afectados estructuras, equipos y maquinarias de metal, así como el crudo mismo, ocasionando daños y pérdidas económicas. La enzima responsable de la reducción desasimilatoria del sulfato es codificada por diferentes genes, entre ellos el más estudiado el gen dsrA, utilizado para la detección y cuantificación de estas bacterias. En este trabajo se estandarizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del gen dsrA, utilizando nuevos oligonucleótidos diseñados previamente por el joven investigador Karen Angarita. Para esto, se hizo un análisis “in silico” de los oligonucleótidos control y los oligonucleótidos con potencial para amplificar el gen de interés, se evaluaron tres polimerasas diferentes y se determinaron los respectivos límites de detección. Los productos amplificados se analizaron mediante geles de agarosa al 1,5 %. Como control positivo se usó el ADN genómico de Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579). Los resultados muestran que los oligonucleótidos diseñados tienen el potencial de ser utilizados para detectar bacterias sulfato reductoras, dado que no mostraron amplificación del ADN de otras posibles bacterias presentes en muestras de interés en la industria del petróleo y con un límite de detección de 1×10−5 ng de ADN de Desulfovibrio vulgaris.PregradoMicrobiólogo Industrial1. INTRODUCCIÓN _________________________________________ 1 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA _________________________ 4 3. JUSTIFICACIÓN _________________________________________ 6 4. HIPÓTESIS _____________________________________________ 7 5. OBJETIVOS ____________________________________________ 8 5.1 Objetivo general ________________________________________ 8 5.2 Objetivos específicos ____________________________________ 8 6. MARCO TEÓRICO _______________________________________ 9 6.1 Bacterias sulfato reductoras _______________________________ 9 6.2 Metabolismo de las BSR _________________________________ 10 6.3 BSR y su impacto en la Industria __________________________ 13 6.4 Afectación de las BSR en la Industria de Petróleo _____________ 15 6.4.1 Corrosión en sistemas de transporte. ___________________ 15 2.4.1.1 Sweet corrosión (CO2 corrosión). ___________________ 16 2.4.1.2 Corrosión ácida (corrosión H2S). ____________________ 17 2.4.1.3 Corrosión por oxigeno (O2). ________________________ 18 2.4.1.4 Corrosión de grietas. _____________________________ 18 2.4.1.5 Corrosión por erosión. ____________________________ 19 2.4.1.6 Corrosión galvánica. _____________________________ 19 2.4.1.7 Corrosión bajo tensión. ___________________________ 19 6.4.2 Corrosión inducida por microorganismos (MIC) o Biocorrosión.____________ 20 6.4.3 Clasificación de las BSR. _____________________________ 21 6.4.3.1 Desulfovibrionaceae. _____________________________ 21 6.4.3.2 Desulfobacteriaceae. _____________________________ 22 6.4.3.3 Gram negativas mesófilas. ________________________ 22 6.4.3.4 Gram positivas formadoras de esporas. ______________ 22 6.5 Métodos para la detección de bacterias sulfato reductoras ______ 24 6.5.1 Microbiológicos. ____________________________________ 24 6.5.1.1 Técnica de número más probable (NMP). ____________ 24 6.5.1.2 Medio de cultivo BSR 10. _________________________ 24 6.5.1.3 Prueba BART. __________________________________ 25 6.5.2 Enzimáticos. _______________________________________ 26 6.5.2.1 Kit QuickChekTM BSR. ____________________________ 26 6.5.2.2 RapidChek® II SRB Test Kit. _______________________ 27 6.5.3 Basados en el ADN. _________________________________ 27 6.5.3.1 Lista de oligonucleótidos diseñados. _________________ 28 7. METODOLOGÍA ________________________________________ 32 7.1 Ubicación ____________________________________________ 32 7.2 Diseño del estudio______________________________________ 32 7.3 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos. ___ 32 7.3.1 Análisis en BLAST. __________________________________ 32 7.4 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA utilizando PCR.____________ 33 7.4.1 Microorganismos de referencia. ________________________ 33 7.4.2 Extracción de ADN. _________________________________ 34 7.4.3 Detección molecular (gen 16s). ________________________ 34 7.4.3.1 Agua de producción. _____________________________ 35 7.4.4 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ____ 35 7.4.4.1 Prueba de amplificación con diferentes polimerasas. ____ 36 7.4.5 Condiciones base para la amplificación del gen dsrA. ______ 36 7.4.5.1 Temperaturas de hibridación y concentración de oligonucleótidos._______________ 37 7.5 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA ________________ 37 7.6 Límite de detección _____________________________________ 38 8. RESULTADOS _________________________________________ 39 8.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos _____ 39 8.2 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA utilizando PCR.______ 42 8.2.1 Microorganismos de referencia. ________________________ 42 8.2.2 Detección molecular (gen 16s) ________________________ 43 8.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ________ 43 8.3.1 Temperaturas de hibridación y concentración de oligonucleótidos__________ 43 8.4 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA ________________ 44 8.5 Límite de detección _____________________________________ 44 9. DISCUSIÓN ____________________________________________ 46 9.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos _____ 46 9.2 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA utilizando PCR__________ 48 9.2.1 Microorganismos de referencia. ________________________ 48 9.2.2 Detección molecular (gen 16s) ________________________ 49 9.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ________ 50 9.3.1 Temperaturas de hibridación y concentración de oligonucleótidos______ 50 9.4 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA ________________ 51 9.5 Límite de detección _____________________________________ 51 10. CONCLUSIONES _____________________________________ 54 11. RECOMENDACIONES _________________________________ 55 12. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________ 56 13. 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Evaluación de nuevas sondas de oligonucleótidos para la detección de bacterias sulfato reductoras

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