Evaluación del Efecto Inhibitorio de la Comunicación Celular de Pectobacterium Carotovorum Generado por el Aislado Stenotrophomonas Sp-HSL25

Digital

Autores:
Escalante-Valek, Mariana
Tipo de recurso:
Trabajo de grado de pregrado
Fecha de publicación:
2021
Institución:
Universidad de Santander
Repositorio:
Repositorio Universidad de Santander
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repositorio.udes.edu.co:001/6451
Acceso en línea:
https://repositorio.udes.edu.co/handle/001/6451
Palabra clave:
Acilasas
Quorum sensing
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openAccess
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spelling Rueda Forero, Nohora Julianafdefebdb-5a74-4c59-ba33-4ff4cc09bca4-1Suarez-Barrera, Miguel Orlando15349590-dcf9-4b0a-a9a3-95cc2ab8353c-1Escalante-Valek, Marianad93730ff-a3f8-4f02-8bb0-aa5f820d5989-12022-04-01T18:23:36Z2022-04-01T18:23:36Z2021-01-18DigitalLas acíl homoserina acilasas son enzimas que integran la superfamilia de las nucleófilo N-terminal (Ntn) hidrolasas, que intervienen en la degradación de señales inductoras tipo acíl homoserina lactona (AHL), su actividad permite detener la comunicación celular (QS). A través de un proyecto de bioprospección realizado en el año 2009 por el grupo de investigación BioMol, se obtuvo el aislado HSL25, identificado como Stenotrophomonas sp por medio de PCR y secuenciación molecular, donde se encontró el gen que codifica a una proteína tipo acilasa atípica, perteneciente a la familia penicilin acilasa; por esta razón, se planteó como objetivo principal evaluar la actividad inhibitoria de Quórum Sensing de la acilasa HSL-25 frente a Pectobacterium carotovorum en modelos de Solanum tuberosum. Anteriormente, Stenotrophomonas sp - HSL25 demostró aprovechar como fuente nutricional diferentes señales AHL, por ello, se efectuaron ensayos para determinar su actividad acilasa utilizando la cepa biosensor Chromobacterium violaceum (CV026) frente a las señales N-butiril-L- homoserina lactona (C4 -AHL), N-hexanoil-L-homoserina lactona (C6- HSL), N-3-oxohexanoil-L-homoserina lactona (3-oxo-C8-HSL), la N- octanoil-L-homoserina lactona (C8-HSL) y N- dodecil homoserina lactona (C12- AHL) sintéticas; adicionalmente y con el fin de asegurar que la actividad se debe únicamente a la acción de la proteína HSL25, se construyó una cepa recombinante que portara el gen descrito para la acilasa. Las cepas nativa y recombinante mostraron alta actividad en la utilización de las señales con cadena acíl lateral corta (C4 Y C6 AHL), a su vez, la suspensión extracelular de HSL25 produjo un efecto completamente inhibitorio sobre la infección causada por Pectobacterium caratovorum que origina la podredumbre blanda de la papa.Acyl homoserine acylases are enzymes that make up the superfamily of nucleophilic N-terminal (Ntn) hydrolases, which are involved in the degradation of inductive signals like acyl homoserine lactone (AHL), their activity quench cell to cell communication (QS). Through a bioprospecting project carried out in 2009 by the BioMol research group, isolate HSL25 was obtained, identified as Stenotrophomonas sp by means of PCR and molecular sequencing, where the gene that encodes an atypical acylase-type protein was found. belonging to the penicillin acylase family; Therefore, the main objective was to evaluate the inhibitory activity of Quorum Sensing of the HSL-25 acylase against Pectobacterium carotovorum in Solanum tuberosum models. Previously, Stenotrophomonas sp - HSL25 used different AHL signals as a nutritional source, hence, were intended to determine their acylase activity using the biosensor strain Chromobacterium violaceum (CV026) against N-butyryl-L- homoserine lactone (C4 - AHL), N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6-HSL), N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL), N-octanoyl-L-homoserine lactone (C8-HSL) and N-dodecyl homoserine lactone (C12-AHL); In addition, to ensure that the activity is solely due to the action of the HSL25 protein, a recombinant strain carrying the gene described for the acylase was constructed. The native and recombinant strains showed high activity degrading signals with a short acyl side chain (C4 and C6 AHL), in turn, the extracellular suspension of HSL25 produced a completely inhibitory effect on the infection caused by Pectobacterium carotovorum that originates the potato soft rot.PregradoMicrobiólogo IndustrialAgradecimientos ............................................................................................................................. 4 Dedicatoria ...................................................................................................................................... 5 Tabla de Contenido ......................................................................................................................... 6 Resumen .......................................................................................................................................... 9 Abstract ......................................................................................................................................... 11 Introducción .................................................................................................................................. 13 Pregunta de Investigación ............................................................................................................. 17 Justificación .................................................................................................................................. 18 Marco Teórico ............................................................................................................................... 20 Comunicación Celular (Quorum Sensing) .................................................................................... 20 Inhibición de la Comunicación Celular (QSI) .............................................................................. 23 Enzimas Degradadoras de Señales AHL ...................................................................................... 25 Marco Referencial ......................................................................................................................... 27 Quorum Sensing de Pectobacterium Carotovorum ...................................................................... 27 Inhibición de la Comunicación Celular (QSI) por Stenotrophomonas sp HSL25 ........................ 28 Marco Legal .................................................................................................................................. 31 Hipótesis ....................................................................................................................................... 32 Objetivos ....................................................................................................................................... 33 Metodología .................................................................................................................................. 34 Caracterización del Aislado HSL25.............................................................................................. 34 Identificación del Gen Responsable de la Actividad QSI ............................................................. 35 Construcción de la Cepa Recombinante HSL25 + DE3BL21 ...................................................... 36 Diseño del Árbol Filogenético del Aislado Stenotrophomonas sp - HSL25 y P. Carotovorum ... 37 Utilización de Señales N- Acil Homoserina Lactona:C4-AHL, C6-AHL y C8-AHL y C12-oxo-AHL .............................................................................................................................................. 38 Cuantificación de Señales N- Acíl Homoserina Lactona (AHL) ................................................. 39 Cuantificación de las Señales AHL Tratadas con el Sobrenadante del Aislado HSL25 ............... 40 Análisis Estadístico de las Concentraciones de las Señales AHL Tratadas con la Proteína Tipo Acilasa HSL25 .............................................................................................................................. 41 Cuantificación de la Proteína Extracelular Total del Aislamiento Stenotrophomonas sp HSL25 41 Establecimiento de la Concentración de la Proteína Extracelular Total del Aislamiento Stenotrophomonas sp HSL25 ....................................................................................................... 41 Determinación del Peso Molecular de las Proteínas Presentes en el Sobrenadante del Cultivo del Aislado HSL25 Mediante Electroforesis en Gel de Poliacrilamida-Dodecilsulfato de Sodio (SDS-PAGE) ................................................................................................................................. 42 Búsqueda de Enzimas AHL Homologas y Dendrograma Filogenético de la Proteína HSL25 ..... 42 Medición y Caracterización de los Bolsillos de Unión al Sitio Catalítico de la Proteína Tipo Acilasa HSL25 .............................................................................................................................. 43 Aislamiento e Identificación de Pectobacterium Carotovorum a Partir de Pudrición Blanda en Solanum tuberosum ....................................................................................................................... 43 Evaluación del Efecto de la Proteína del Aislado Stenotrophomonas Sp-HSL25 Sobre la Pudrición Blanda Causada por P. Carotovorum ........................................................................................... 44 Resultados ..................................................................................................................................... 45 HSL25 es Stenotrophomonas sp ................................................................................................... 45 Stenotrophomonas sp- HSL25 Codifica una Proteína Tipo Acilasa, Atípica ................................ 48 Enzimas AHL Homologas y Dendrograma Filogenético de la Proteína HSL25 .......................... 49 La Proteína Tipo Acilasa de HSL 25 Tiene un Peso Molecular entre 19-20 KDa ....................... 50 Señales C4, C6, C8, C6-oxo y C12-oxo-AHL Cuantificadas con el Biosensor CV026 .............. 53 Determinación de Hidrólisis de Señales AHLs Mediada por la Acilasa HSL25 ........................... 56 La Proteína Tipo Acilasa de HSL25 Disminuye la Severidad de la Pudrición Blanda Causada por P. Caratovorum............................................................................................................................. 57 Análisis de Chi Cuadrado para los Datos de Violaceína .............................................................. 58 Discusión....................................................................................................................................... 61 Conclusiones ................................................................................................................................. 65 Recomendaciones ......................................................................................................................... 66 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 67 Apéndices ...................................................................................................................................... 76 Apéndice A. Contig Ensamblado para HSL25, 16S HSL25 16S Gene (1479 nt) ........................ 76 Apéndice B. Amplicón HSL25 PAO1F y PAO1R ....................................................................... 7879 papplication/pdfT 33.21 E811ehttps://repositorio.udes.edu.co/handle/001/6451spaFacultad de Ciencias Exactas, Naturales y AgropecuariasBucaramanga, ColombiaMicrobiología IndustrialDerechos Reservados - Universidad de Santander, 2021info:eu-repo/semantics/openAccessAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/http://purl.org/coar/access_right/c_abf2AcilasasQuorum sensingStenotrophomonas spPectobacterium carotovorumAcylasesQuorum sensingEvaluación del Efecto Inhibitorio de la Comunicación Celular de Pectobacterium Carotovorum Generado por el Aislado Stenotrophomonas Sp-HSL25Trabajo de grado - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTextinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttps://purl.org/redcol/resource_type/TPhttp://purl.org/coar/version/c_71e4c1898caa6e32Todas las AudienciasBassler, B y Losick, R. 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