Evaluación del Aptámero Diseñado “in silico” para la Detección Electroquímica de Escherichia coli O157:H7 en Matrices Acuosas

Digital

Autores:
León Sánchez, Wendy Rocío
Tipo de recurso:
Trabajo de grado de pregrado
Fecha de publicación:
2020
Institución:
Universidad de Santander
Repositorio:
Repositorio Universidad de Santander
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repositorio.udes.edu.co:001/5527
Acceso en línea:
https://repositorio.udes.edu.co/handle/001/5527
Palabra clave:
Escherichia coli
Biosensor
Aptámeros
Sensibilidad
Selectividad
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openAccess
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Derechos Reservados - Universidad de Santander, 2020
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spelling Ropero Vega, José Luise7157eec-65cc-4753-98b0-11f8d272045a-1Valdivieso Quintero, Wilfredo8a364218-619a-4695-a854-44b943784e23-1Flórez Castillo, Johanna-Marcela54298018-2f22-4018-a2ed-a40309cf1e82-1León Sánchez, Wendy Rocíoc7470559-a7e6-4bdb-99d4-6e7e23a2e42f-12021-08-20T19:57:17Z2021-08-20T19:57:17Z2020-12-17DigitalEscherichia coli enterohemorrágica (O157:H7) es un microorganismo Gram negativo y uno de los patógenos más importantes para el ser humano. Su principal mecanismo de patogenicidad es la expresión de la toxina shiga, ya que ocasiona graves daños al epitelio intestinal. Actualmente existen diversos mecanismos para la detección de este microorganismo; entre ellos está la filtración por membrana y la cuantificación molecular. Sin embargo, cada una de estas técnicas tiene limitaciones como el tiempo que se requiere para obtener algún resultado, la capacitación que del personal y los altos costos del equipamiento. Por lo anterior surge la necesidad de nuevos métodos que permitan la detección rápida y sensible de este microorganismo. Por lo cual, en este trabajo se desarrolló de un aptasensor electroquímico cuya molécula de reconocimiento consiste en un aptámero diseñado “in silico” que permite la detección de Escherichia coli en matrices acuosas. Para esto se realizó una revisión bibliográfica sobre artículos científicos, que trataran de aptasensores diseñados para la detección de Escherichia coli y a partir de ellos se construyó una base de datos con la información más importante de cada uno. Todos estos datos se analizaron y a partir de las mejores secuencias se inició la construcción, agregando fragmentos necesarios para que fuera un aptámero “in silico” completamente funcional. El aptámero diseñado fue inmovilizado sobre electrodos serigrafiados modificados con nanopartículas de oro y la detección electroquímica se realizó a través de EIS (Espectroscopía de impedancia electroquímica), CV (Voltametría cíclica) y SWV (Voltametría de onda cuadrada). De los cuales se obtuvo que los electrodos que mostraron mejor comportamiento fueron el 1 y 2 por lo que se podría concluir que la electrodeposición de oro a +0.05mV beneficia la detección de Escherichia coli O157:H7, además es importante mencionar que el método “in silico” puede ser una gran alternativa para diseñar y obtener aptámeros.Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157: H7) is one of the most important human pathogens. Its main pathogenicity mechanism is the expression of shiga toxin, since it causes serious damage to the intestinal epithelium and produces hemolytic uremic syndrome. Currently there're various mechanisms for the detection of this microorganism in aqueous matrices; among them are membrane filtration and molecular quantification. However, each of these techniques has limitations such as the time required to obtain a result, the training required by the personnel and the high costs of the equipment. Therefore, arises the need to design new methods that allow the rapid and sensitive detection of this microorganism. In this work, an electrochemical aptasensor was developed, whose recognition molecule consists of an “in silico” designed aptamer that allows the detection of E. coli in aqueous matrices. For this, a bibliographic review was carried out on scientific articles, which dealt with aptasensors designed for the detection of E. coli and from them, a database was built with the most important information of each one, such as the type of biosensor, the dissociation constant, the complete sequence that made up the aptamer. All these data were analyzed and from the best sequences the construction began, adding fragments necessary to make it a fully functional “in silico” aptamer. The designed aptamer was immobilized on silkscreened electrodes modified with gold nanoparticles and electrochemical detection was carried out through EIS (Electrochemical Impedance Spectroscopy), CV (Cyclic Voltammetry) and SWV (Square Wave Voltammetry). It was found that the electrodes that showed the best behavior were 1 and 2, so it could be concluded that the electrodeposition of gold at + 0.05mV benefits the detection of E. coli O157: H7. In addition, it's important to mention that the “in silico” method can be a great alternative to design and obtain aptamers.PregradoMicrobiólogo Industrial1 ed.Resumen ........................................................................................................................................ 12 Abstract ......................................................................................................................................... 14 Introducción .................................................................................................................................. 16 1. Objetivos ......................................................................................................................... 18 1.1 Objetivo General ............................................................................................................. 18 1.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 18 2. Marco de Antecedentes ................................................................................................... 19 2.1 Detección por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). ........................................ 19 2.2 Colorimetría .................................................................................................................... 20 2.3 Fluorescencia .................................................................................................................. 21 2.4 Biosensores Electroquímicos .......................................................................................... 22 3. Marco Teórico ................................................................................................................ 25 3.1 Enfermedades Transmitidas por Alimentos .................................................................... 25 3.2 Escherichia coli O157:H7 .............................................................................................. 25 3.2.1 Generalidades y Taxonomía ........................................................................................... 25 3.2.2 Patogenicidad .................................................................................................................. 26 3.3 Métodos de Detección .................................................................................................... 27 3.3.1 Filtración por Membrana ................................................................................................ 27 3.3.2 Métodos Moleculares (qPCR) ........................................................................................ 28 3.3.3 Método del Número Más Probable ................................................................................. 29 3.4 Biosensores ..................................................................................................................... 30 3.4.1 Biosensores Electroquímicos .......................................................................................... 32 3.4.2 Técnica Electroquímica .................................................................................................. 33 3.5 Aptámeros ....................................................................................................................... 36 3.5.1 Ventajas y Limitantes ..................................................................................................... 38 4. Marco Legal .................................................................................................................... 40 5. Metodología .................................................................................................................... 42 5.1 Diseño de Aptámero “in silico” ..................................................................................... 42 5.2 Acondicionamiento de Electrodos Serigrafiados ............................................................ 43 5.3 Inmovilización del Aptámero ......................................................................................... 45 5.4 Detección Electroquímica de Escherichia coli O157:H7 ............................................... 46 6. Resultados y Discusión ................................................................................................... 49 6.1 Diseño “in silico” del Aptámero 917A. .......................................................................... 49 6.2 Caracterización de los Electrodos Iniciales .................................................................... 52 6.3 Inmovilización del Aptámero sobre el Electrodo Modificado con AuNP ...................... 58 6.4 Detección de Escherichia coli O157:H7 por medio de Aptasensor. .............................. 63 7. Conclusiones ................................................................................................................... 69 8. Recomendaciones ........................................................................................................... 70 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 71 Apéndices ...................................................................................................................................... 7579 papplication/pdfT 33.20 L266ihttps://repositorio.udes.edu.co/handle/001/5527spaBucaramanga : Universidad de Santander, 2020Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y AgropecuariasBucaramanga, ColombiaMicrobiología IndustrialDerechos Reservados - Universidad de Santander, 2020info:eu-repo/semantics/openAccessAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/http://purl.org/coar/access_right/c_abf2Escherichia coliBiosensorAptámerosSensibilidadSelectividadEscherichia coli O15:H7AptamersSensitivitySelectivityEvaluación del Aptámero Diseñado “in silico” para la Detección Electroquímica de Escherichia coli O157:H7 en Matrices AcuosasTrabajo de grado - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTextinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttps://purl.org/redcol/resource_type/TPhttp://purl.org/coar/version/c_71e4c1898caa6e32Todas las AudienciasBaudry B, Savarino S, Vial P, Kaper J, Levine M. 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An Aptamer-Based Biosensor for Colorimetric Detection of Escherichia coli O157:H7.PloS ONE; 7: 1.PublicationORIGINALEvaluacióndelAptámeroDiseñado“in silico”paralaDetecciónElectroquímicadeEscherichiacoliO157H7enMatricesAcuosas.pdfEvaluacióndelAptámeroDiseñado“in silico”paralaDetecciónElectroquímicadeEscherichiacoliO157H7enMatricesAcuosas.pdfDocumento Principalapplication/pdf2738052https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/950a3491-17ae-4df1-b2f9-44b899db8dfe/download300a45c752e578a7cfdd8ded54f823b4MD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-859https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/07b55339-eda2-41a3-a3b1-0b13b592c1d0/download38d94cf55aa1bf2dac1a736ac45c881cMD52TEXTEvaluacióndelAptámeroDiseñado“in silico”paralaDetecciónElectroquímicadeEscherichiacoliO157H7enMatricesAcuosas.pdf.txtEvaluacióndelAptámeroDiseñado“in silico”paralaDetecciónElectroquímicadeEscherichiacoliO157H7enMatricesAcuosas.pdf.txtExtracted texttext/plain102115https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/114196b6-bdc2-44cd-9542-c812721d1b8d/downloadacd0df1ee49ced31006ebddea872c29bMD53THUMBNAILEvaluacióndelAptámeroDiseñado“in silico”paralaDetecciónElectroquímicadeEscherichiacoliO157H7enMatricesAcuosas.pdf.jpgEvaluacióndelAptámeroDiseñado“in silico”paralaDetecciónElectroquímicadeEscherichiacoliO157H7enMatricesAcuosas.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg5684https://repositorio.udes.edu.co/bitstreams/d5a6e9a3-da2b-410e-9d41-0260f4b42076/download9d40649bf0cfa29c83df6c48f8f80e9cMD54001/5527oai:repositorio.udes.edu.co:001/55272022-10-25 10:16:12.229https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Derechos Reservados - Universidad de Santander, 2020https://repositorio.udes.edu.coRepositorio Universidad de Santandersoporte@metabiblioteca.comTGljZW5jaWEgZGUgUHVibGljYWNpw7NuIFVERVMKRGlyZWN0cmljZXMgZGUgVVNPIHkgQUNDRVNPCgo=

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